WikiDer > Аффинный электрофорез

Affinity electrophoresis
Количественный принцип аффинного электрофореза проиллюстрирован с помощью электрофореза при pH 8,6 конканавалин А в агарозный гель, содержащий сыворотку крови (3,6 микролитра на квадратный см). Полоска показывает 1 см. Электрофорез проводят в течение ночи при менее 10 В / см. Анализ был проведен в начале 1970-х годов в Белковой лаборатории.

Аффинный электрофорез это общее название для многих аналитических методов, используемых в биохимия и биотехнология. Как качественная, так и количественная информация может быть получена с помощью аффинного электрофореза. Методы включают так называемые анализ сдвига электрофоретической подвижности, электрофорез со сдвигом заряда и сродство капиллярный электрофорез. Методы основаны на изменении электрофоретический структура молекул (в основном макромолекулы) через биоспецифическое взаимодействие или сложное образование. Взаимодействие или связывание заряженной или незаряженной молекулы обычно изменяет электрофоретические свойства молекулы.[1] Мембранные белки можно идентифицировать по сдвигу подвижности, вызванному заряженным моющее средство. Нуклеиновых кислот или фрагменты нуклеиновой кислоты могут характеризоваться их сродством к другим молекулам. Методы использовались для оценки константы привязки, как, например, в лектин аффинный электрофорез или характеристика молекул с такими специфическими характеристиками, как гликан содержание или лиганд привязка. Для ферментов и других лиганд-связывающих белков одномерный электрофорез аналогичен противоэлектрофорезу или «ракетный иммуноэлектрофорез», аффинный электрофорез может быть использован в качестве альтернативного количественного определения белка.[2] Некоторые методы похожи на аффинная хроматография с использованием иммобилизованных лиганды.

Виды и методы

В настоящее время продолжаются исследования по разработке новых способов использования знаний, уже связанных с аффинным электрофорезом, для улучшения его функций и скорости, а также попытки улучшить уже установленные методы и адаптировать их для выполнения конкретных задач.

Электрофорез в агарозном геле

пример геля агарозы после электрофореза

Тип анализа сдвига электрофоретической подвижности (AMSA), электрофорез в агарозном геле, используется для отделения связанных с белком аминокислотных комплексов от свободных аминокислот. Используя низкое напряжение (~ 10 В / см), чтобы минимизировать риск теплового повреждения, через агарозный гель пропускают электричество.

Быстрый электрофорез в агарозном геле

В этом методе используется высокое напряжение (≥ 20 В / см) с 0,5-кратным трис-боратным буфером через агарозный гель.[3] Этот метод отличается от традиционного электрофореза в агарозном геле тем, что в нем используется более высокое напряжение, что обеспечивает более короткое время анализа, а также дает более высокое разрешение полос. Другими факторами, включенными в разработку метода быстрого электрофореза в агарозном геле, являются толщина геля и процентное содержание агарозы в геле.

Электрофорез сродства бороната

В электрофорезе с боронатным сродством используются акрилимидные гели, насыщенные бороновой кислотой, для очистки НАД-РНК. Эта очистка позволяет исследователям легко измерять кинетическую активность ферментов, разрушающих НАД-РНК.[4]

Аффинный капиллярный электрофорез

Аффинный капиллярный электрофорез (АПФ) относится к ряду методов, которые полагаются на специфические и неспецифические связывающие взаимодействия для облегчения разделения и обнаружения с помощью формульного подхода в соответствии с теорией электромиграция.[5] Используя межмолекулярные взаимодействия между молекулами, происходящими в свободном растворе или мобилизованными на твердом носителе, ACE позволяет разделять и количественно определять концентрации аналитов, а также константы связывания и диссоциации между молекулами.[6][7] С помощью ACE ученые надеются разработать сильные связывающие лекарства-кандидаты, понять и измерить ферментативную активность и охарактеризовать заряды белков.[8] Аффинный капиллярный электрофорез можно разделить на три различных метода: неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов, динамический равновесный АПФ и АПФ на основе аффинности.[6]

Неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов обычно используется для разделения и изучения связывающих взаимодействий больших белков и включает объединение как анализируемого вещества, так и его рецепторной молекулы в предварительно смешанном образце. Эти рецепторные молекулы часто имеют форму аффинных зондов, состоящих из молекул, меченных флуорофором, которые будут связываться с молекулами-мишенями, которые смешиваются с исследуемым образцом.[6] Затем эту смесь и ее последующие комплексы разделяют с помощью капиллярного электрофореза.[6] Поскольку исходная смесь анализируемого вещества и молекулы рецептора были связаны вместе в равновесии, медленная диссоциация этих двух связанных молекул во время электрофоретического эксперимента приведет к их разделению и последующему смещению равновесия в сторону дальнейшей диссоциации.[9] Характерный рисунок мазка, полученный в результате медленного высвобождения аналита из комплекса во время эксперимента, можно использовать для расчета константы диссоциации комплекса.[9]

Динамическое равновесие ACE включает комбинацию анализируемого вещества, обнаруженного в образце, и его рецепторную молекулу, обнаруженную в буферном растворе в капиллярной трубке, так что связывание и разделение происходят только в приборе.[6] Для капиллярного электрофореза с динамическим равновесием сродства предполагается, что связывание лиганд-рецептор происходит быстро, когда аналит и буфер смешиваются. Константы связывания обычно получают с помощью этого метода на основе сдвига пика миграции рецептора, который зависит от концентрации аналита в образце.[6]

Капиллярный электрофорез на основе аффинности, также известный как капиллярная электроаффинная хроматография (CEC), включает связывание анализируемого вещества в образце с иммобилизованной молекулой рецептора на стенке капилляра, микрошариках или микроканалах.[10] CEC предлагает самую высокую эффективность разделения из всех трех методов ACE, поскольку нематричные компоненты образца вымываются, а затем высвобождается и анализируется лиганд.[6]  

Аффинный капиллярный электрофорез использует преимущества капиллярного электрофореза и применяет их для изучения взаимодействия белков.[8] ACE выгоден, потому что он имеет высокую эффективность разделения, имеет более короткое время анализа, может работать при физиологическом pH и включает низкое потребление лиганда / молекул.[11][12] Кроме того, для проведения исследований АПФ необязательно знать состав интересующего белка.[8] Однако основным недостатком является то, что он не дает много стехиометрической информации об исследуемой реакции.[12]

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой (PAGE) стал одним из самых популярных методов разделения белков. Это связано не только с его разделяющими качествами, но и с тем, что его можно использовать в сочетании с множеством других аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг.[7] В этом методе используется двухэтапный подход. Сначала образец белка пропускают через полиакриламидный гель с помощью электрофореза. Затем образец переносят в другой полиакриламидный гель (гель с аффинной ловушкой), где иммобилизованы аффинные зонды. Белки, не обладающие сродством к зондам сродства, проходят через гель-ловушку сродства, а белки со сродством к зондам будут «захвачены» неподвижными зондами сродства. Эти захваченные белки затем визуализируются и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии после расщепления в геле.[7]

Электрофорез сродства фосфата

В электрофорезе сродства к фосфату используется аффинный зонд, который состоит из молекулы, которая специфически связывается с ионами двухвалентного фосфата в нейтральном водном растворе, известном как «Phos-Tag». В этих методах также используется разделительный гель, состоящий из сополимеризованного мономера Phos-Tag с акриламидной связкой. Фосфорилированные белки медленно мигрируют в геле по сравнению с нефосфорилированными белками. Этот метод дает исследователю возможность наблюдать различия в состояниях фосфорилирования любого данного белка.[7]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Айзпуруа-Олайзола, Ойер; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Fu, Ou; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж .; Питерс, Роланд Дж. (Январь 2018 г.). "Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов". Электрофорез. 39 (2): 344–347. Дои:10.1002 / elps.201700207. PMID 28905402.
  2. ^ Диб, Сами Эл; Wätzig, Hermann; Эль-Хади, Дея Абд (июль 2013 г.). «Капиллярный электрофорез для исследования биофармацевтических препаратов и фармацевтически значимых связывающих свойств». Тенденции TrAC в аналитической химии. 48: 112–131. Дои:10.1016 / j.trac.2013.04.005.
  3. ^ Рим Дж. А., Льюис Л. К., Льюис К. А. (октябрь 2016 г.). «Быстрый анализ сдвига электрофоретической подвижности в агарозном геле для количественного определения белка: взаимодействия РНК». Аналитическая биохимия. 511: 36–41. Дои:10.1016 / j.ab.2016.07.027. ЧВК 5002362. PMID 27495142.
  4. ^ «Боронатный аффинный электрофорез для очистки и анализа РНК, модифицированной кофактором». Институт фармации и молекулярной биотехнологии, Гейдельбергский университет, 69120 Гейдельберг, Германия.
  5. ^ Дубский П., Дворжак М., Ансорге М. (2016). «Аффинный капиллярный электрофорез: теория электромиграции». Аналитическая и биоаналитическая химия. 408 (30): 8623–8641. Дои:10.1007 / s00216-016-9799-y. PMID 27558099.
  6. ^ а б c d е ж г Heegaard, Niels H.H; Нильссон, Стаффан; Гусман, Норберто А (1998-09-11). «Аффинный капиллярный электрофорез: важные области применения и некоторые недавние разработки». Журнал хроматографии B: биомедицинские науки и приложения. 715 (1): 29–54. Дои:10.1016 / S0378-4347 (98) 00258-8. ISSN 0378-4347. PMID 9792496.
  7. ^ а б c d Киношита, Эйдзи; Киношита-Кикута, Эмико; Коике, Тору (18 марта 2015 г.). «Передовая технология аффинного электрофореза». Протеомы. 3 (1): 42–55. Дои:10.3390 / протеомы3010042. ЧВК 5302491. PMID 28248262.
  8. ^ а б c Чу, Йен-Хо; Авила, Луис З .; Гао, Цзиньминь; Уайтсайдс, Джордж М. (ноябрь 1995 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез». Отчеты о химических исследованиях. 28 (11): 461–468. Дои:10.1021 / ar00059a004. ISSN 0001-4842.
  9. ^ а б Крылов, Сергей Н. (2006). «Неравновесный капиллярный электрофорез равновесных смесей (NECEEM): новый метод биомолекулярного скрининга». Журнал биомолекулярного скрининга. 11 (2): 115–122. Дои:10.1177/1087057105284339. ISSN 1087-0571. PMID 16418314.
  10. ^ Динджес, Мередит М .; Солакиилдирим, Кемаль; Ларив, Синтия К. (май 2014 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для определения аффинности связывания для низкомолекулярных гепаринов и антитромбина-III: CE и CEC». Электрофорез. 35 (10): 1469–1477. Дои:10.1002 / elps.201300549. PMID 24616065.
  11. ^ Ю, Фангжи; Чжао, Цян; Чжан, Дапенг; Юань, Чжэн; Ван, Хайлинь (2019-01-02). «Аффинные взаимодействия с помощью капиллярного электрофореза: связывание, разделение и обнаружение». Аналитическая химия. 91 (1): 372–387. Дои:10.1021 / acs.analchem.8b04741. ISSN 0003-2700. PMID 30392351.
  12. ^ а б "Аффинный капиллярный электрофорез | Учебный центр MyBioSource". Получено 2019-12-13.

внешняя ссылка