WikiDer > Шеврон сюжет

Chevron plot
Типичный шевронный график, наблюдаемый в сворачивание белка эксперименты.

А шеврон сюжет это способ представления сворачивание белка кинетический данные в присутствии различных концентраций денатурирующий агент что нарушает естественный белок третичная структура. Сюжет получил название «шевронный» из-за каноничности v, или же шеврон форма наблюдается, когда логарифм наблюдаемых скорость релаксации график как функция концентрации денатуранта.

В системе с двумя состояниями скорости сворачивания и разворачивания доминируют над наблюдаемыми скоростями релаксации ниже и выше средняя точка денатурации (См). Это дает начало терминологии складывания и раскладывания рук для конечностей шеврона. Априорную информацию о Cm белка можно получить из экспериментов по равновесию. При подгонке к модели с двумя состояниями предполагается, что логарифм скоростей сворачивания и разворачивания линейно зависит от концентрации денатуранта, что приводит к склоны мж И мты, называемые m-значениями сворачивания и разворачивания соответственно (также называемые кинетическими m-значениями). Сумма двух скоростей и есть наблюдаемая скорость релаксации. Согласование между равновесным значением m и абсолютной суммой кинетических значений m обычно рассматривается как признак поведения двух состояний. Большинство описанных экспериментов по денатурации было проведено в 298 К либо с мочевина или же гуанидин хлорид (GuHCl) в качестве денатурирующих средств.

Экспериментальная методика

Чтобы создать складывающуюся часть шеврона, белок в высококонцентрированном растворе денатуранта быстро (менее чем за миллисекунду) разбавляют в соответствующем буфере до определенной концентрации денатуранта с помощью остановился поток аппарат. Релаксация к новому равновесию контролируется спектроскопический зонды, такие как флуоресценция или реже круговой дихроизм (CD). Объем разбавления регулируется для получения скорости релаксации при конкретной концентрации денатуранта. Конечная концентрация белка в смеси обычно составляет 1-20 мкМ, в зависимости от ограничений, налагаемых амплитудой релаксации и отношением сигнал / шум. Разворачивающаяся конечность создается аналогичным образом путем смешивания белка без денатурирующего агента с концентрированным раствором денатурирующего агента в буфере. Когда логарифм этих скоростей релаксации отображается как функция конечной концентрации денатуранта, получается шевронный график.

Смешивание растворов определяет мертвое время инструмента, что составляет около миллисекунды. Следовательно, аппарат с остановленным потоком можно использовать только для белков с временем релаксации в несколько миллисекунд. В случаях, когда время релаксации короче мертвого времени прибора, экспериментальная температура понижается (тем самым увеличивая вязкость воды / буфера), чтобы увеличить время релаксации до нескольких миллисекунд. С другой стороны, для белков с быстрым сворачиванием (т.е. белков со скоростью релаксации от 1 до 100 микросекунд), скачок давления (мертвое время ~ несколько микросекунд),[1] скачок температуры (T-скачок; мертвое время ~ несколько наносекунд) или непрерывное перемешивание потока (мертвое время ~ несколько микросекунд),[2] могут быть выполнены при различных концентрациях денатуранта для получения шевронной диаграммы.

Шеврон перевёртывается

Хотя предполагается, что конечности шеврона линейны в зависимости от концентрации денатуранта, это не всегда так. Нелинейности обычно наблюдаются либо на обеих конечностях, либо на одной из них, и их называют перекатыванием шеврона. Причина такого наблюдения не ясна. Множество интерпретаций, включая промежуточные звенья пути,[3] ограничения мертвого времени, переходное состояние движения (Эффект Хаммонда),[4] артефакты агрегации,[5] складывание под гору,[6] и солевой Дебай-Хюккель последствия[7] были предложены, чтобы объяснить это поведение. Во многих случаях переворачивание складок конечностей игнорируется, поскольку они происходят при низких концентрациях денатуранта, и данные соответствуют модели с двумя состояниями с линейной зависимостью скоростей. Скорости сворачивания, указанные для таких белков в отсутствие денатурантов, поэтому являются завышенной оценкой.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Дженкинс, округ Колумбия, Пирсон Д.С., Харви А., Сильвестр И.Д., Дживз М.А., Пинейро Т. (2009). «Быстрое сворачивание прионного белка, захваченного скачком давления». Eur Biophys J. 38 (5): 625–35. Дои:10.1007 / s00249-009-0420-6. ЧВК 4509520. PMID 19255752.
  2. ^ Фергюсон Н., Джонсон С.М., Масиас М., Ошкинат Х., Фершт А. (2001). «Сверхбыстрое сворачивание WW-доменов без структурированных ароматических кластеров в денатурированном состоянии». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 98 (23): 13002–13007. Bibcode:2001PNAS ... 9813002F. Дои:10.1073 / pnas.221467198. ЧВК 60814. PMID 11687613.
  3. ^ Санчес И.Е., Кифхабер Т. (2003). «Доказательства последовательных барьеров и обязательных промежуточных продуктов в очевидном двухуровневом сворачивании белка». J. Mol. Биол. 325 (2): 367–376. Дои:10.1016 / S0022-2836 (02) 01230-5. PMID 12488101.
  4. ^ Тернстрем Т., мэр У., Акке М., Оливеберг М. (1999). «От снимка к фильму: φ-анализ переходных состояний сворачивания белка сделал еще один шаг вперед». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 96 (26): 14854–14859. Bibcode:1999PNAS ... 9614854T. Дои:10.1073 / пнас.96.26.14854. ЧВК 24737. PMID 10611302.
  5. ^ Пошел, ХМ; Бенитес-Кардоза, CG; Джексон, SE (2004). «Населяется ли промежуточное состояние на пути сворачивания убиквитина?». Письма FEBS. 567 (2–3): 333–8. Дои:10.1016 / j.febslet.2004.04.089. PMID 15178347.
  6. ^ Кая Х, Чан Х (2003). «Истоки переворачивания шевронов в кинетике сворачивания белков без двух состояний». Phys. Rev. Lett. 90 (258104–1): 258104–4. arXiv:cond-mat / 0302305. Bibcode:2003ПхРвЛ..90y8104K. Дои:10.1103 / PhysRevLett.90.258104. PMID 12857173.
  7. ^ Риос М., Плакско К. (2005). «Очевидные эффекты Дебая-Хюккеля в сворачивании простого однодоменного белка». Биохимия. 44 (4): 1243–1250. Дои:10.1021 / bi048444l. PMID 15667218.