WikiDer > ChiRP-Seq

ChiRP-Seq

ChiRP-Seq (Выделение хроматина РНК очищение) является высокопроизводительное секвенирование метод обнаружения регионов геном которые связаны определенной РНК (или рибонуклеопротеином, содержащим интересующую РНК). Недавние исследования показали, что значительная часть некоторых геномов (включая геномы мыши и человека) синтезирует РНК, которая, по-видимому, не кодирует белки. Функции большинства из них некодирующая РНК еще предстоит выяснить. Разрабатываются различные геномные методы для картирования функциональной ассоциации этих новых РНК с отдельными участками генома, чтобы лучше понять их функцию. ChiRP-Seq - один из этих новых методов, в котором используется возможность массового параллельного секвенирования секвенсоров 2-го поколения для каталогизации сайтов связывания этих новых молекул РНК в геноме.

Обзор метода

Десятки олигонуклеотид зонды предназначены для комплементации интересующей РНК. Эти олиго помечены биотин. Клетки сшиты УФ или же формалин и ядра выделяют из этих обработанных клеток. Выделенные ядра лизировали, а высвободившийся хроматин фрагментировали обработка ультразвуком для получения фрагментов размером примерно 100-500 п.н. Эти фрагменты хроматина гибридизовали с набором биотинилированных зондов. Комплексы, содержащие биотин-зонд + интересующая РНК + фрагмент ДНК, захватываются магнитными шариками, помеченными стрептавидин.

Обзор метода секвенирования следующего поколения для характеристики сайтов связывания РНК с хроматином. Выделение хроматина очисткой РНК.

ДНК выделяют из аликвоты связанного комплекса обработкой РНКаза (или протеиназа с последующей РНКазой) для переваривания ассоциированного белка и РНК. РНК также может быть выделена из дополнительной аликвоты связанного комплекса для обнаружения других молекул РНК, связанных с интересующей РНК. Затем очищенная ДНК используется для подготовки библиотеки секвенирования, и эта библиотека секвенируется в системе секвенирования ДНК следующего поколения. Затем данные секвенирования сопоставляются с геномом. Накопление считываний в определенных местах генома указывает на то, что интересующая РНК связана с этой областью генома. Это помогает очертить определенные области генома, которые взаимодействуют с РНК. Например, геномные мишени энхансерной РНК, которые действуют на расстоянии от места их синтеза, можно легко оценить с помощью ChiRP-Seq.[1][2]

Рекомендации

  1. ^ Чу, Ки; Цюй, Кун; Чжун, Франклин Л .; Artandi, Steven E .; Чанг, Ховард Ю. (31 августа 2011 г.). "Геномные карты длинного некодирующего присутствия РНК раскрывают принципы взаимодействия РНК-хроматин". Молекулярная клетка. 44: 667–678. Дои:10.1016 / j.molcel.2011.08.027. ЧВК 3249421. PMID 21963238.
  2. ^ Li, W .; Notani, D .; Ma, Q .; Tanasa, B .; Nunez, E .; и другие. (2013). «Функциональная роль энхансерных РНК в эстроген-зависимой активации транскрипции». Природа. 498: 516–520. Дои:10.1038 / природа12210. ЧВК 3718886. PMID 23728302.