WikiDer > Анализ следа ДНКазы

DNase footprinting assay
След ДНКазыI связывания белка с радиоактивно меченным фрагментом ДНК. Дорожки «GA» и «TC» представляют собой дорожки химического секвенирования Максама-Гилберта, см. Секвенирование ДНК. Дорожка, обозначенная как «контроль», предназначена для контроля качества и содержит фрагмент ДНК, но не обработана ДНКазаЯ.

А Анализ следа ДНКазы[1] это ДНК-след техника из молекулярная биология/биохимия это обнаруживает ДНК-белок взаимодействие с использованием того факта, что белок, связанный с ДНК, часто защищает эту ДНК от ферментативного расщепления. Это позволяет найти сайт связывания белка на конкретной молекуле ДНК. В методе используется фермент, дезоксирибонуклеаза (Сокращенно ДНКаза), чтобы разрезать ДНК с радиоактивной меткой, за которой следует гель-электрофорез для обнаружения результирующего рисунка расщепления.

Например, интересующий фрагмент ДНК может быть ПЦР усилен с помощью 32Праймер, меченный P 5 ', в результате чего получается множество молекул ДНК с радиоактивной меткой на одном конце одной цепи каждой двухцепочечной молекулы. Расщепление ДНКазой приведет к образованию фрагментов. Фрагменты меньшего размера относительно 32Р-меченный конец будет появляться на геле дальше, чем более длинные фрагменты. Затем гель используется для экспонирования специальной фотопленки.

Картина расщепления ДНК в отсутствие ДНК-связывающего белка, обычно называемая свободной ДНК, сравнивается с картиной расщепления ДНК в присутствии ДНК-связывающего белка. Если белок связывает ДНК, сайт связывания защищен от ферментативного расщепления. Эта защита приведет к появлению на геле чистой области, называемой «отпечатком».

Изменяя концентрацию ДНК-связывающего белка, можно оценить сродство связывания белка в соответствии с минимальной концентрацией белка, при которой наблюдается след.

Этот метод был разработан Дэвидом Галасом и Альбертом Шмитцем в Женеве в 1977 году.[2]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Бреновиц М., Сеньар Д.Ф., Ши М.А., Акерс Г.К. (1986). «Количественное титрование следа ДНКазы: метод изучения взаимодействий белок-ДНК». Методы в энзимологии. 130: 132–81. Дои:10.1016/0076-6879(86)30011-9. ISBN 9780121820305. PMID 3773731.
  2. ^ Galas DJ, Schmitz A (сентябрь 1978 г.). «ДНК-следы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 5 (9): 3157–70. Дои:10.1093 / nar / 5.9.3157. ЧВК 342238. PMID 212715.