WikiDer > Вытесняющая хроматография

Вытесняющая хроматография это хроматография техника, при которой образец помещается в верхнюю часть колонны^{[n 1]} а затем смещается на растворенное вещество который сорбируется сильнее, чем компоненты исходной смеси. В результате компоненты разделены на последовательные «прямоугольные» зоны высококонцентрированных чистых веществ, а не на «пики», разделенные растворителем.^[1] Это прежде всего препаративная техника; более высокая концентрация продукта, более высокая чистота и повышенная производительность могут быть получены по сравнению с другими режимами хроматографии.

Открытие

Появление вытеснительной хроматографии можно отнести к Арне Тизелиус,^[2] кто в 1943 году первым классифицировал режимы хроматография как фронтальный, элюирование, и смещение. Вытесняющая хроматография нашла множество применений, включая выделение трансурановые элементы ^[3] и биохимические образования.^[4]Техника была переработана Чаба Хорват,^[5] которые использовали современные колонны и оборудование высокого давления. С тех пор он нашел множество применений, особенно в области очистки биологических макромолекул.

Принцип

Пример изотермы Ленгмюра для популяции сайтов связывания, имеющих однородное сродство. В этом случае вертикальная ось представляет количество, ограниченное на единицу стационарной фазы, горизонтальная ось - концентрацию в подвижной фазе. В этом случае константа диссоциации равна 0,5, а емкость 10; единицы произвольные.

Основной принцип вытеснительной хроматографии: существует только конечное число сайтов связывания растворенных веществ на матрице (неподвижная фаза), и если сайт занят одной молекулой, он недоступен для других. Как и в любой хроматографии, равновесие устанавливается между молекулами определенного вида, связанными с матрицей, и молекулами того же вида, свободными в растворе. Поскольку количество сайтов связывания конечно, когда концентрация свободных молекул в растворе велика по сравнению с константа диссоциации для сайтов эти сайты будут в основном заполнены. Это приводит к искривлению вниз графика границы против свободное растворенное вещество, в простейшем случае дающее Изотерма Ленгмюра^{[n 2]}. Молекула с высоким близость поскольку матрица (вытеснитель) будет более эффективно конкурировать за сайты связывания, оставляя подвижную фазу обогащенной растворенным веществом с более низким сродством. Поток подвижной фазы через колонку предпочтительно уносит растворенное вещество с более низким сродством, и, таким образом, при высокой концентрации растворенное вещество с более высоким сродством в конечном итоге вытесняет все молекулы с меньшим сродством.

Режим работы

Загрузка

В начале цикла смесь растворенных веществ, которые необходимо разделить, наносят на колонку в условиях, выбранных для обеспечения высокого удерживания.^{[n 3]} Растворенные вещества с более высоким сродством предпочтительно удерживаются около головки колонны, а растворенные вещества с более низким сродством перемещаются дальше по потоку. Самый быстро движущийся компонент начинает формировать чистую зону ниже по потоку. Другие компоненты также начинают образовывать зоны, но непрерывная подача смешанного сырья в головку колонны препятствует полному разрешению.

Смещение

После того, как весь образец загружен, подача переключается на вытеснитель, который имеет более высокое сродство, чем любой компонент образца.^{[n 4]} Вытеснитель образует зону с острыми краями в верхней части колонны, выталкивая другие компоненты вниз по потоку. Каждый компонент пробы теперь действует как вытеснитель для растворенных веществ с более низким сродством, и растворенные вещества сортируются в серию смежных полос («последовательность вытеснения»), все перемещающиеся вниз по потоку со скоростью, установленной вытеснителем. Размер и загрузка столбца выбираются таким образом, чтобы процесс сортировки завершился до того, как компоненты достигнут нижней части столбца. Растворенные вещества появляются в нижней части колонки в виде серии смежных зон, каждая из которых состоит из одного очищенного компонента, с равномерной концентрацией в каждой отдельной зоне.

Регенерация

После элюирования последнего растворенного вещества необходимо удалить вытеснитель из колонки. Поскольку вытеснитель был выбран из-за высокого сродства, это может создать проблему. Для материалов с обращенной фазой может быть достаточно промывки с высоким содержанием органического растворителя. Также часто используются большие сдвиги pH. Одна из эффективных стратегий - удалить вытеснитель с помощью химической реакции; например, если ион водорода использовался в качестве вытеснителя, его можно удалить реакцией с гидроксидом, или ион поливалентного металла можно удалить реакцией с хелатирующим агентом. Для некоторых матриц реактивные группы на неподвижной фазе можно титровать для временного устранения участков связывания, например, слабокислотные ионообменники или хелатирующие смолы могут быть преобразованы в протонированную форму. Для гелевых ионообменников изменение селективности при очень высокой ионной силе также может обеспечить решение. Иногда вытеснитель специально разработан с титруемой функциональной группой для изменения его аффинности. После промывки буйка колонка промывается по мере необходимости, чтобы восстановить ее исходное состояние для следующего цикла.^[6][7][8]

Сравнение с элюционной хроматографией

Общие основы

В любой форме хроматографии скорость, с которой растворенное вещество движется по колонке, напрямую отражает процент времени, в течение которого растворенное вещество находится в подвижной фазе. Для достижения разделения при элюционной или вытеснительной хроматографии должны быть заметные различия в сродстве соответствующих растворенных веществ к неподвижной фазе. Оба метода основаны на движении вниз по колонке для усиления эффекта небольших различий в распределении между двумя фазами. Распределение между подвижной и неподвижной фазами описывается изотермой связывания, графиком растворенного вещества, связанного (или распределенного) в неподвижной фазе как функции концентрации в подвижной фазе. Изотерма часто бывает линейной или приблизительно такой же при низких концентрациях, но обычно изгибается (вогнутая вниз) при более высоких концентрациях, когда стационарная фаза становится насыщенной.

Характеристики режима элюирования

В режиме элюирования растворенные вещества наносятся на колонку в виде узких полос и при низкой концентрации движутся вниз по колонке примерно как Гауссовский пики. Эти пики продолжают расширяться по мере продвижения пропорционально квадратному корню из пройденного расстояния. Для разделения двух веществ они должны перемещаться вниз по колонке с достаточно разными скоростями, чтобы преодолеть эффекты растекания полосы. Работа при высокой концентрации, когда изотерма изогнута, является невыгодной для элюирующей хроматографии, поскольку скорость перемещения в этом случае зависит от концентрации, вызывая распространение и искажение пиков.

Удерживание при элюирующей хроматографии обычно регулируется путем регулирования состава подвижной фазы (с точки зрения состава растворителя, pH, ионной силы и т.д.) в соответствии с типом используемой стационарной фазы и конкретными растворенными веществами, которые необходимо разделить. Компоненты подвижной фазы обычно имеют более низкое сродство к неподвижной фазе, чем разделяемые растворенные вещества, но присутствуют в более высокой концентрации и достигают своего эффекта за счет массовое действие. Разрешение в элюционной хроматографии обычно лучше, когда пики сильно сохраняются, но условия, которые дают хорошее разрешение ранних пиков, приводят к длительному времени анализа и чрезмерному расширению более поздних пиков, если только градиентное элюирование Используется. Градиентное оборудование увеличивает сложность и стоимость, особенно в больших масштабах.

Достоинства и недостатки режима вытеснения

В отличие от элюционной хроматографии растворенные вещества, разделенные в режиме замещения, образуют зоны с острыми краями, а не растекающиеся пики. Границы зон в вытеснительной хроматографии самозатачиваются: если молекула по какой-то причине опережает свою полосу, она попадает в зону, в которой она удерживается сильнее, и затем будет двигаться медленнее, пока ее зона не догонит. Более того, поскольку вытесняющая хроматография использует нелинейность изотерм, нагрузки намеренно высоки; большее количество материала может быть отделено на данной колонке за заданное время, при этом очищенные компоненты извлекаются при значительно более высоких концентрациях. Условия удерживания все еще можно регулировать, но вытеснитель контролирует скорость миграции растворенных веществ. Вытеснитель выбирается так, чтобы иметь более высокое сродство к стационарной фазе, чем любое из разделяемых растворенных веществ, и его концентрация устанавливается так, чтобы приближаться к насыщению стационарной фазы и обеспечивать желаемую скорость миграции волны концентрации. Условия высокого удерживания могут использоваться без градиентной операции, поскольку вытеснитель обеспечивает удаление всех представляющих интерес растворенных веществ в течение расчетного времени работы.^[6][7][8]

Из-за концентрирующего эффекта загрузки колонки в условиях высокого удерживания, вытесняющая хроматография хорошо подходит для очистки компонентов из разбавленных исходных потоков. Однако также возможно сконцентрировать материал из разбавленного потока в верхней части хроматографической колонки, а затем переключить условия для элюирования адсорбированного материала в обычных изократических или градиентных режимах. Следовательно, этот подход не является уникальным для вытеснительной хроматографии, хотя более высокая емкость загрузки и меньшее разбавление позволяют повысить концентрацию в вытесняющем режиме.

Недостатком вытесняющей хроматографии является то, что неидеальность всегда приводит к возникновению зоны перекрытия между каждой парой компонентов; эту смешанную зону необходимо собрать отдельно для повторного использования или выбросить, чтобы сохранить чистоту отделенных материалов. Стратегия добавления спейсерных молекул для образования зон между компонентами (иногда называемая «хроматография смещения носителя») была исследована.^[9] и может быть полезным, когда найдены подходящие, легко снимаемые прокладки. Другой недостаток заключается в том, что необработанная хроматограмма, например график поглощение или же показатель преломления против Объем элюирования может быть трудно интерпретировать для смежных зон, особенно если последовательность вытеснения не полностью развита. Для документирования и устранения неполадок может потребоваться дополнительный химический анализ для установления распределения данного компонента. Другой недостаток заключается в том, что время, необходимое для регенерации, ограничивает производительность.

Согласно статье Джона К. Форда в Энциклопедия хроматографии, теоретические исследования показывают, что, по крайней мере, для некоторых систем оптимизированная хроматография с перегруженной элюцией обеспечивает более высокую производительность, чем вытесняющая хроматография, хотя ограниченные экспериментальные тесты показывают, что вытесняющая хроматография лучше (по крайней мере, без учета времени регенерации).^[7]

Приложения

Исторически вытесняющая хроматография применялась для препаративного разделения аминокислот и редкоземельных элементов, а также исследовалась для разделения изотопов.^{[9][10][11][12]}

Белки

Хроматографическая очистка белков из сложных смесей может быть довольно сложной задачей, особенно когда смеси содержат аналогично удерживаемые белки или когда желательно обогатить следовые компоненты в корме. Кроме того, загрузка колонки часто ограничивается, когда требуется высокое разрешение с использованием традиционных режимов хроматографии (например, линейный градиент, изократический хроматография). В этих случаях вытесняющая хроматография является эффективным методом очистки белков из сложных смесей при высокой загрузке колонки в различных областях.

Важным достижением в области вытесняющей хроматографии явилась разработка низкоуровневой хроматографии. молекулярная масса вытеснители для очистки белков в ионообменных системах.^[13][14][15] Это исследование было значительным, поскольку представляло собой серьезный отход от общепринятого мнения о том, что полиэлектролит полимеры необходимы для вытеснения белков в ионообменных системах.

Низкомолекулярные вытеснители имеют значительные эксплуатационные преимущества по сравнению с большими полиэлектролитными вытеснителями. Например, если есть какое-либо перекрытие между вытеснителем и интересующим белком, эти низкомолекулярные материалы могут быть легко отделены от очищенного белка во время обработки после вытеснения с использованием методов очистки на основе стандартных размеров (например, эксклюзионная хроматография, ультрафильтрация). Кроме того, солевой адсорбция Поведение этих вытеснителей с низкой молекулярной массой значительно облегчает регенерацию колонки. Эти вытеснители использовались для широкого спектра разделений с высоким разрешением в ионообменных системах.^{[16][17][18][19][20][21][22]} Кроме того, использование вытесняющей хроматографии для очистки рекомбинантный факторы роста,^[23] антигенный вакцина белки^[24] и антисмысловые олигонуклеотиды^[25] также был продемонстрирован. Есть несколько примеров, в которых вытесняющая хроматография применялась для очистки белков с использованием ионный обмен, гидрофобное взаимодействие, а также обращенно-фазовая хроматография.^[26]

Вытесняющая хроматография хорошо подходит для получения очищенных белков из сложных смесей с использованием стандартных аналитических хроматографических колонок в лабораторном масштабе. Он также особенно хорошо подходит для обогащения микрокомпонентов в кормах. Вытесняющая хроматография может быть легко проведена с использованием различных систем смол, включая ионообменную, HIC и RPLC. ^[27]

Двумерная хроматография

Двумерная хроматография представляет собой наиболее тщательный и строгий подход к оценке протеом. В то время как ранее принятые подходы использовали хроматографические подходы в режиме элюирования, такие как катион обмен на обращенную фазу ВЭЖХ, выходы обычно очень низкие, что требует аналитической чувствительности от пикомолярного до фемтомолярного диапазона.^[28] Поскольку вытесняющая хроматография предлагает преимущество концентрации микрокомпонентов, двумерная хроматография, использующая вытесняющий, а не элюирующий режим на этапе предварительной хроматографии, представляет собой потенциально мощный инструмент для анализа микрокомпонентов, модификаций и идентификации минорных экспрессируемых компонентов протеома.

Примечания

Рекомендации