WikiDer > Технология шлюза

Gateway Technology

В Система клонирования шлюза, изобретенный и коммерциализированный Invitrogen с конца 1990-х годов это метод молекулярной биологии, который позволяет исследователям эффективно переносить фрагменты ДНК между плазмиды с использованием собственного набора рекомбинационных последовательностей, сайтов "Gateway att" и двух патентованных смесей ферментов, называемых "LR Clonase" и "BP Clonase". Технология клонирования шлюза позволяет переносить фрагменты ДНК между разными векторами клонирования, сохраняя при этом рамка чтения. Используя Gateway, можно клонировать субклон Сегменты ДНК для функционального анализа. Система требует первоначальной вставки фрагмента ДНК в плазмиду с двумя фланкирующими рекомбинационными последовательностями, называемыми «att L 1» и «att L 2», для создания «входного клона шлюза» (специальная номенклатура Invitrogen).

Большие архивы клонов Gateway Entry, содержащие подавляющее большинство ORF человека, мыши и крысы (открытые рамки для чтения) были клонированы от человека кДНК библиотеки или химически синтезированы для поддержки исследовательского сообщества, использующего Национальные институты здравоохранения США (Национальные институты здравоохранения) финансирование (например, Коллекция генов млекопитающих, http://mgc.nci.nih.gov/). Наличие этих генных кассет в стандартной плазмиде для клонирования Gateway помогает исследователям быстро переводить эти кассеты в плазмиды, которые облегчают анализ функции генов. Клонирование шлюза требует больше времени на первоначальную настройку и дороже, чем традиционные методы клонирования с помощью ферментов рестрикции и лигазы, но оно экономит время и предлагает более простое и высокоэффективное клонирование для последующих приложений.

Эта технология была широко принята сообществом исследователей наук о жизни, особенно для приложений, которые требуют переноса тысяч фрагментов ДНК в один тип плазмиды (например, содержащий промотор CMV для экспрессии белка в клетках млекопитающих) или для переноса один фрагмент ДНК во множество различных типов плазмид (например, для экспрессии белков бактерий, насекомых и млекопитающих).

Основные шаги

Первым шагом клонирования шлюза является подготовка клона входа шлюза. Входные клоны часто делаются в два этапа:

1) Последовательности Gateway attB1 и attB2 добавляются к 5 ’и 3’ конца фрагмента гена, соответственно, с использованием специфичных для генов праймеров ПЦР и ПЦР-усиление;

2) продукты ПЦР-амплификации затем смешивают со специальным плазмиды называется Gateway «Донорские векторы» (номенклатура Invitrogen) и патентованная смесь ферментов «BP Clonase». Смесь ферментов катализирует рекомбинацию и встраивание продукта ПЦР, содержащего att-B-последовательность, в сайты рекомбинации att P в векторе-доноре шлюза. Когда кассета является частью целевой плазмиды, она называется «входной клон» в номенклатуре шлюза, а рекомбинационные последовательности упоминаются как шлюз типа «att L».

Кассета гена в клоне Gateway Entry затем может быть просто и эффективно перенесена в любой вектор-адресат шлюза (номенклатура Invitrogen для любой плазмиды Gateway, которая содержит последовательности рекомбинации Gateway «att R» и элементы, такие как промоторы и метки эпитопа, но не ORF) с использованием запатентованной смеси ферментов «LR Clonase». Созданы тысячи плазмид Gateway Destination, которые бесплатно распространяются среди исследователей по всему миру. Векторы-адресаты шлюза аналогичны классическим векторам экспрессии, содержащим несколько сайтов клонирования, перед вставкой интересующего гена с использованием переваривания рестриктазами и лигирования. Векторы назначения шлюза коммерчески доступны от Invitrogen, EMD (Novagen) и Ковалис.

Поскольку при клонировании Gateway используются запатентованные последовательности рекомбинации и патентованные смеси ферментов, доступные только от Invitrogen, эта технология не позволяет исследователям менять поставщиков и способствует эффект блокировки всех таких запатентованных процедур.

Подводя итог различным этапам клонирования шлюза:

  • Реакция Gateway BP: продукт ПЦР с фланкирующими сайтами att B (на этом этапе также могут использоваться другие методы выделения ДНК, такие как рестрикционное расщепление) + вектор-донор, содержащий сайты att P + клоназа BP => клон входа шлюза, содержащий сайты att L , фланкирующий интересующий ген
  • Реакция шлюзового LR: входной клон, содержащий сайты att L + целевой вектор, содержащий сайты att R, а также промоторы и теги + клоназа LR => клон экспрессии, содержащий сайты att B, фланкирующий интересующий ген, готовый для экспрессии гена.

Смотрите также

Рекомендации

  • [1]
  • Хартли Дж. Л., Темпл Г. Ф., Браш Массачусетс (ноябрь 2000 г.). «Клонирование ДНК с использованием сайт-специфической рекомбинации in vitro». Genome Res. 10 (11): 1788–95. Дои:10.1101 / гр.143000. ЧВК 310948. PMID 11076863.
  • Катцен Ф (апрель 2007 г.). "Gateway (®) рекомбинационное клонирование: биологическая операционная система". Экспертное мнение Drug Discov. 2 (4): 571–89. Дои:10.1517/17460441.2.4.571. PMID 23484762.
  • Фрейлер Ф., Стеттлер Т., Мейерхофер М., Ледер Л., Майр Л. М. (июнь 2008 г.). «Разработка новой векторной системы на основе шлюза для эффективной мультипараллельной экспрессии белков в Escherichia coli». Protein Expr. Purif. 59 (2): 232–41. Дои:10.1016 / j.pep.2008.02.003. PMID 18375142.