WikiDer > Экстракция геля - Википедия

В молекулярная биология, экстракция геля или же гелевая изоляция это метод, используемый для выделения желаемого фрагмента интактной ДНК из агарозный гель следующий электрофорез в агарозном геле. После экстракции интересующие фрагменты могут быть смешаны, осаждены и ферментативно лигированы вместе в несколько простых шагов. Этот процесс, обычно выполняемый на плазмиды, является основой элементарных генная инженерия.

После того, как образцы ДНК обрабатываются на агарозном геле, экстракция включает четыре основных этапа: определение интересующих фрагментов, выделение соответствующих полос, выделение ДНК из этих полос и удаление соответствующих солей и окрашивания.

Начать, УФ-излучение сияет на геле, чтобы осветить все этидиум бромид-окрашенная ДНК. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не подвергать ДНК воздействию мутагенного излучения дольше, чем это абсолютно необходимо. Желаемая полоса идентифицируется и физически удаляется с помощью покровное стекло или же лезвие бритвы. Удаленный кусочек геля должен содержать внутри нужную ДНК. Альтернативный метод, использующий гелевое окрашивание ДНК SYBR Safe и освещение синим светом, позволяет избежать повреждения ДНК, связанного с бромидом этидия и УФ-светом.^[1]

Существует несколько стратегий выделения и очистки интересующего фрагмента ДНК.

Экстракция из вращающейся колонки

Наборы для экстракции геля доступны от нескольких крупных производителей биотехнологий по окончательной цене примерно 1-2 доллара США за образец. Протоколы, включенные в эти наборы, обычно требуют растворения гелевого среза в 3 объемах хаотропного агента при 50 ° C с последующим нанесением раствора на спин-колонку (ДНК остается в колонке), 70% этанола. промывка (ДНК остается в колонке, соль и примеси вымываются) и элюирование ДНК в небольшом объеме (30 мкл) воды или буфера.^[2]

Диализ

Фрагмент геля помещается в диализная трубка которая проницаема для жидкостей, но непроницаема для молекул размером с ДНК, что препятствует прохождению ДНК через мембрану при впитывании TE буфер. Вокруг трубки создается электрическое поле (аналогично гелевому электрофрезу), достаточное для того, чтобы ДНК удалялась из геля, но оставалась в трубке. Затем раствор из пробирки может быть добавлен пипеткой и будет содержать желаемую ДНК с минимальным фоном.

Традиционный

Традиционный метод экстракции геля включает создание сложенного кармана из вощеной бумаги Parafilm и размещение внутри него фрагмента агарозы. Агароза физически вдавливается пальцем в угол кармана, частично разжижая гель и его содержимое. Затем капли жидкости могут быть направлены из кармана на внешний кусок Parafilm, где они помещены в небольшую трубку. Экстракция бутанолом удаляет пятно бромистого этидия с последующей экстракцией очищенного фрагмента ДНК фенолом / хлороформом.

Недостатком гелевой изоляции является то, что фон можно удалить только в том случае, если его можно физически идентифицировать с помощью УФ-излучения. Если две полосы расположены очень близко друг к другу, их может быть трудно разделить без какого-либо загрязнения. Для того чтобы четко идентифицировать интересующую полосу, могут потребоваться дальнейшие рестрикционные переваривания. Сайты ограничения, уникальные для нежелательных полос аналогичного размера, могут помочь в устранении этих потенциальных загрязнителей.

Рекомендации

внешняя ссылка