WikiDer > Клонирование Золотых Ворот

Golden Gate Cloning
Сборка Golden Gate включает переваривание последовательностей ДНК, содержащих сайт разреза рестрикционного фермента типа IIS, и их лигирование.

Клонирование Golden Gate или же Сборка Golden Gate[1] это молекулярное клонирование метод, который позволяет исследователю одновременно и направленно собирать несколько ДНК фрагменты в единое целое с использованием Ферменты рестрикции типа II и ДНК-лигаза Т4.[2] Эта сборка выполняется in vitro. Наиболее часто используемые ферменты типа IIS включают BsaI, BsmBI и BbsI.

В отличие от стандартных ферментов рестрикции типа II, таких как EcoRI и BamHIэти ферменты разрезают ДНК за пределами их сайтов узнавания и, следовательно, могут создавать непалиндромные выступы.[3] Поскольку возможны 256 потенциальных выступающих последовательностей, можно собрать несколько фрагментов ДНК, используя комбинации выступающих последовательностей.[3] На практике это означает, что клонирование Golden Gate обычно безболезненно. Кроме того, поскольку конечный продукт не имеет сайта узнавания рестрикционного фермента типа II, правильно лигированный продукт не может быть снова разрезан рестрикционным ферментом, что означает, что реакция по существу необратима.[3]

Типичный термоциклер протокол колеблется от 37 ° C (оптимально для рестрикционных ферментов) до 16 ° C (оптимально для лигаз) много раз.[4] Хотя этот метод можно использовать для одной вставки, исследователи использовали клонирование по Золотым воротам для одновременной сборки множества фрагментов ДНК.[5]

Бесшовное клонирование

Последовательности рубцов обычны в сборке многосегментной ДНК. В методе многосегментной сборки Gateway сегменты добавляются в донор с дополнительными последовательностями att, которые перекрываются в этих добавленных сегментах, и в результате сегменты разделяются последовательностями att.[6] В BioBrick После сборки, последовательность из восьми нуклеотидов, которая кодирует тирозин и стоп-кодон, остается между каждым сегментом, добавленным в плазмиду.[6]

Сборка Golden Gate использует ферменты рестрикции типа II, вырезающие их последовательности распознавания.[6] Кроме того, один и тот же рестрикционный фермент типа II может генерировать множество различных выступов на вставках и векторе, например, BsaI создает 256 выступов из четырех пар оснований.[6] Если выступы тщательно спроектированы, сегменты лигируются без рубцовых последовательностей между ними, и конечная конструкция может быть квази-рубцовой, где сайты рестрикционных ферментов остаются с обеих сторон вставки.[6] Поскольку дополнительные сегменты могут быть вставлены в векторы без рубцов в пределах открытой рамки считывания, Golden Gate широко используется в белковая инженерия.[6]

Плазмидный дизайн

Хотя Golden Gate Cloning ускоряет многосегментное клонирование, требуется тщательный дизайн плазмид донора и реципиента.[5] На каждом этапе клонирования Golden Gate Cloning может собирать до девяти фрагментов и требует только гомологии сайтов рестрикционных ферментов типа II, чтобы фрагменты ДНК можно было легко лигировать.[5] После лигирования фрагментов продукт не будет иметь сайта рестрикции IIS исходного типа и впоследствии не будет повторно перевариваться при реакции лигирования.[5] Между тем, исходные сайты рестрикции, которые не были лигированы, можно переваривать, чтобы они могли добавить больше фрагментов в плазмиду.[5] Если фрагменты ДНК хорошо разработаны, чтобы быть совместимыми друг с другом, их можно лигировать в линейном порядке за один этап.[5]

Стандарты клонирования

Сборка ДНК рестрикционного фермента имеет стандарты клонирования, чтобы минимизировать изменение эффективности клонирования и функции плазмиды, которое может быть вызвано совместимостью сайтов рестрикции на вставке и в векторе.[7]

Стандарты клонирования сборки Golden Gate имеют два уровня.[7] Сборка Golden Gate первого уровня создает конструкцию с одним геном путем добавления генетических элементов, таких как промотор, открытые рамки считывания и терминаторы.[7] Затем сборка Golden Gate второго уровня объединяет несколько конструкций, созданных на сборке первого уровня, для создания мультигенной конструкции.[7] Для обеспечения сборки второго уровня используются система модульного клонирования (MoClo) и стандарт GoldenBraid2.0.[7]

Система MoClo

Схема рабочего процесса для создания сложных комбинаторных библиотек ДНК

MoClo использует параллельный подход, при котором все конструкции первого уровня (модули уровня 0) имеют сайты ограничения для BpiI по обе стороны от вставок. Вектор (также известный как «вектор-адресат»), в который будут добавляться гены, имеет обращенный наружу сайт рестрикции BsaI с выпадающей кассетой для скрининга.[7] LacZ - это обычная кассета для скрининга, в которой она заменяется мультигенной конструкцией на векторе назначения.[7] Каждая конструкция первого уровня и вектор имеют разные выступы на них, но дополняют выступ следующего сегмента, и это определяет компоновку окончательной мультигенной конструкции.[7] Клонирование Golden Gate обычно начинается с модулей 0 уровня.[5] Однако, если модуль уровня 0 слишком велик, клонирование начнется с фрагментов уровня -1, которые необходимо секвенировать, чтобы облегчить клонирование большой конструкции.[5] Если начиная с фрагментов уровня -1, модули уровня 0 не нужно снова упорядочивать, тогда как, начиная с модулей уровня 0, модули должны быть упорядочены.[5]

Модули уровня 0

Модули уровня 0 являются основой для системы MoClo, где они содержат генетические элементы, такие как промотор, 5 'нетранслируемую область (UTR), кодирующую последовательность и терминатор.[5] Для целей клонирования Golden Gate внутренние последовательности модулей уровня 0 не должны содержать сайтов рестрикционных ферментов типа IIS для BsaI, BpiI и Esp3I, будучи окруженными двумя сайтами рестрикции BsaI в перевернутой ориентации.[5] Модули уровня 0 без фланкирования сайтов ограничения типа IIS могут добавлять сайты BsaI в процессе клонирования Golden Gate.[5]

Если модули уровня 0 содержат какой-либо нежелательный сайт рестрикции, они могут быть мутированы in silico путем удаления одного нуклеотида из сайта рестрикции типа IIS.[5] В этом процессе необходимо убедиться, что введенная мутация не повлияет на генетическую функцию, кодируемую интересующей последовательностью.[5] Молчащая мутация в кодирующей последовательности является предпочтительной, поскольку она не изменяет ни последовательность белка, ни функцию интересующего гена.[5]

Фрагменты уровня -1

Фрагменты уровня -1 используются для клонирования больших модулей нулевого уровня.[5] Для клонирования фрагментов уровня -1 можно использовать клонирование по тупому концу с рестрикционным лигированием.[5] Вектор, используемый в клонировании фрагментов уровня -1, не может содержать сайт рестрикции IIS типа BpiI, который используется на следующем этапе сборки.[5] Более того, вектор также должен иметь маркер отбора, отличный от целевого вектора на следующем этапе сборки, например, если устойчивость к спектиномицину используется в модулях уровня 0, фрагменты уровня -1 должны иметь другую устойчивость к антибиотикам, такую ​​как ампициллин.[5] 

Конструкции уровня 1

Вектор-адресат уровня 1 определяет положение и ориентацию каждого гена в конечной конструкции.[8] Существует четырнадцать доступных векторов уровня 1, которые различаются только последовательностью фланкирующих сайтов слияния, но идентичны по внутренним сайтам слияния.[8] Следовательно, все векторы могут собирать одинаковые части нулевого уровня.[8]

Поскольку все векторы уровня 1 являются бинарными плазмидами, они используются для Агробактерии опосредованная временная экспрессия в растениях.[8]

Конструкции уровня 2

Векторы уровня 2 имеют два инвертированных сайта BpiI от вставки модулей уровня 1.[8] Сайт слияния выше по течению совместим с геном, клонированным в векторе уровня 1, тогда как сайт слияния ниже по течению имеет универсальную последовательность.[8] Каждое клонирование позволяет вставить 2-6 генов в один и тот же вектор.[8]

Добавление большего количества генов за один шаг клонирования не рекомендуется, поскольку это приведет к неправильным конструкциям.[8] С одной стороны, это может вызвать больше сайтов рестрикции в конструкции, где эта открытая конструкция позволяет добавлять дополнительные гены.[8] С другой стороны, это также может устранить сайты рестрикции, где эта закрытая конструкция останавливает дальнейшее добавление генов.[8]

Следовательно, конструкции из более чем шести генов нуждаются в последовательных этапах клонирования, для которых требуются концевые линкеры, содержащие внутренние сайты рестрикции BsaI или BsmBI и синие или фиолетовые маркеры.[8] На каждом этапе клонирования необходимо чередовать сайт рестрикции и маркер.[8] Кроме того, необходимы два рестрикционных фермента, где BpiI используется для высвобождения модулей уровня 1 из конструкций уровня 1, а BsaI / BsmBI используется для переваривания и открытия плазмиды реципиентного уровня 2-n.[8] При скрининге правильные колонии должны чередоваться с синего на фиолетовый на каждом этапе клонирования, но если используется «закрытый» концевой линкер, колонии будут белыми.[8] 

Конструкции уровня М

Векторы уровня M аналогичны векторам уровня 2, но имеют сайт BsaI, расположенный выше двух инвертированных сайтов BpiI.[9] Когда один или несколько генов клонируются в векторе уровня M, второй BsaI добавляется в конец конструкции через концевой линкер уровня M (ref). Это позволяет вырезать из вектора фрагмент, содержащий все собранные гены, и субклонировать на следующем уровне клонирования (уровень P).

Конструкции уровня P

Векторы уровня P аналогичны конструкциям уровня M, за исключением того, что сайты BpiI заменены сайтами BsaI, а сайты BsaI заменены сайтами BpiI. Несколько конструкций уровня M с совместимыми сайтами слияния можно субклонировать в вектор уровня P за один этап. Теоретически до 36 генов могут быть собраны в одну конструкцию с использованием 6 параллельных реакций уровня М (каждая требуется для сборки 6 генов на конструкцию уровня М), за которыми следует одна конечная реакция уровня Р. На практике обычно собирается меньше генов, поскольку большинство проектов клонирования не требует такого большого количества генов. Структура векторов уровня M и P разработана таким образом, что гены, клонированные в конструкциях уровня P, могут быть дополнительно собраны в векторах уровня M. Повторное клонирование в векторах уровня M и P образует петлю, которая может повторяться бесконечно для сборки прогрессивно больших конструкций.

GoldenBraid

При стандартном клонировании Golden Gate рестрикционные сайты из конструкции предыдущего уровня не могут быть повторно использованы.[10] Чтобы добавить в конструкцию больше генов, необходимо добавить сайты рестрикции рестрикционного фермента IIS другого типа в целевой вектор.[10] Это можно сделать с помощью уровня 2 или M и P. GoldenBraid также предоставляет вариант уровня M и P.

GoldenBraid решает проблему проектирования множества векторов назначения за счет двойного цикла, который является «косой», позволяющий выполнять двоичную сборку нескольких конструкций.[10] Есть два уровня плазмид-адресатов, уровень α и уровень Ω.[10] Каждый уровень плазмид можно использовать в качестве начальных плазмид для другого уровня плазмид несколько раз, потому что оба уровня плазмид имеют сайты рестрикции IIS разных типов, которые находятся в обратной ориентации.[10] Для контрселекции два уровня плазмид различаются маркерами устойчивости к антибиотикам.[10]

Золотой мутагенез

Принцип клонирования «Золотые ворота» также можно применять для осуществления мутагенеза, называемого «золотым мутагенезом». Эту технологию легко реализовать, поскольку доступен веб-инструмент для создания учебников (https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/), а векторы депонируются в addgene (http://www.addgene.org/browse/article/28196591/).[11]

Рекомендации

  1. ^ Энглер, Карола; Кандзия, Роми; Марильонне, Сильвестр (2008-11-05). «Один горшок, один шаг, прецизионный метод клонирования с высокой пропускной способностью». PLOS ONE. 3 (11): e3647. Bibcode:2008PLoSO ... 3.3647E. Дои:10.1371 / journal.pone.0003647. ISSN 1932-6203. ЧВК 2574415. PMID 18985154.
  2. ^ Биолаборатории, Новая Англия. "Золотые Ворота Ассамблеи | NEB". www.neb.com. Получено 2017-04-26.
  3. ^ а б c Вебер, Эрнст; Энглер, Карола; Грюцнер, Рамона; Вернер, Стефан; Марильонне, Сильвестр (18 февраля 2011 г.). «Модульная система клонирования для стандартизированной сборки мультигенных конструкций». PLOS ONE. 6 (2): e16765. Bibcode:2011PLoSO ... 616765W. Дои:10.1371 / journal.pone.0016765. ISSN 1932-6203. ЧВК 3041749. PMID 21364738.
  4. ^ Энглер, Карола; Грюцнер, Рамона; Кандзия, Роми; Марильонне, Сильвестр (14 мая 2009 г.). "Golden Gate Shuffling: Метод перетасовки ДНК в одном горшке, основанный на рестрикционных ферментах типа II". PLOS ONE. 4 (5): e5553. Bibcode:2009PLoSO ... 4.5553E. Дои:10.1371 / journal.pone.0005553. ISSN 1932-6203. ЧВК 2677662. PMID 19436741.
  5. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п q р s Энглер, Карола; Марильонне, Сильвестр (01.01.2014). «Клонирование Золотых Ворот». Методы молекулярной биологии. 1116: 119–131. Дои:10.1007/978-1-62703-764-8_9. ISBN 978-1-62703-763-1. ISSN 1940-6029. PMID 24395361.
  6. ^ а б c d е ж Пески, Брайан; Брент, Роджер (01.01.2016). «Обзор методов пост-Коэна-Бойера для клонирования одного сегмента и сборки многосегментной ДНК». Текущие протоколы в молекулярной биологии. 113 (1): 3.26.1–3.26.20. Дои:10.1002 / 0471142727.mb0326s113. ISSN 1934-3647. ЧВК 4853029. PMID 27152131.
  7. ^ а б c d е ж грамм час Казини, Артуро; Сторч, Марко; Болдуин, Джеффри С .; Эллис, Том (2015). «Кубики и чертежи: методы и стандарты сборки ДНК» (PDF). Обзоры природы. Молекулярная клеточная биология. 16 (9): 568–576. Дои:10.1038 / nrm4014. HDL:10044/1/31281. ISSN 1471-0080. PMID 26081612.
  8. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п Марильонне, Сильвестр; Вернер, Стефан (01.01.2015). «Сборка мультигенных конструкций с использованием клонирования Golden Gate». Методы молекулярной биологии. 1321: 269–284. Дои:10.1007/978-1-4939-2760-9_19. ISBN 978-1-4939-2759-3. ISSN 1940-6029. PMID 26082229.
  9. ^ Вернер С., Энглер С., Вебер Е., Грюцнер Р., Мариллоннет С. Биоенг. Ошибки. 2012, 1 января; 3 (1): 38-43.
  10. ^ а б c d е ж Саррион-Пердигонес, Алехандро; Фалькони, Эрика Эльвира; Зандалинас, Сара I .; Хуарес, Палома; Фернандес-дель-Кармен, Асун; Гранель, Антонио; Орзаэс, Диего (07.07.2011). «GoldenBraid: итеративная система клонирования для стандартизированной сборки многоразовых генетических модулей». PLOS ONE. 6 (7): e21622. Bibcode:2011PLoSO ... 621622S. Дои:10.1371 / journal.pone.0021622. ISSN 1932-6203. ЧВК 3131274. PMID 21750718.
  11. ^ Паскаль Пюллманн, Крис Ульпиннис, Сильвестр Мариллоннет, Рамона Грейцнер, Штеффен Нойман (2019-07-29), «Золотой мутагенез: эффективный подход к мутагенезу с множественным насыщением путем клонирования Golden Gate с автоматизированным дизайном праймеров» Научные отчеты (на немецком), 9 (1), стр. 1–11, Bibcode:2019НатСР ... 910932П, Дои:10.1038 / s41598-019-47376-1, ISSN 2045-2322, ЧВК 6662682, PMID 31358887CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)