WikiDer > Иммуноокрашивание

Immunostaining
Микрофотография из GFAP иммуноокрашенный участок Опухоль головного мозга.

В биохимия, иммуноокрашивание любое использование антитело-основанный метод обнаружения специфических белок в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимическое окрашивание срезов тканей, как впервые описано Альберт Кунс в 1941 г.[1] Однако в настоящее время иммуноокрашивание включает в себя широкий спектр методов, используемых в гистология, клеточная биология, и молекулярная биология которые используют методы окрашивания на основе антител.

Методы

Иммуногистохимия

Основная статья: Иммуногистохимия

Иммуногистохимическое или ИГХ окрашивание ткань разделы (или иммуноцитохимия, что является окрашиванием клетки), пожалуй, наиболее часто применяемый метод иммуноокрашивания.[2] В то время как первые случаи окрашивания ИГХ использовали флуоресцентный красители (видеть иммунофлуоресценция), другие нефлуоресцентные методы с использованием ферменты Такие как пероксидаза (видеть окрашивание иммунопероксидазой) и щелочная фосфатаза сейчас используются. Эти ферменты способны катализировать реакции, которые дают окрашенный продукт, который легко обнаруживается при свете. микроскопия. В качестве альтернативы, радиоактивный элементы могут использоваться как метки, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиография.[3]

Подготовка ткани или фиксация необходим для сохранения морфологии клеток и архитектуры тканей. Неправильная или продолжительная фиксация может значительно снизить способность связывания антител. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы в формалин-фиксированный парафин-вложенные срезы тканей. Однако некоторые антигены не выдерживают даже умеренной фиксации альдегида. В этих условиях ткани следует быстро заморозить в жидкий азот и режем криостатом. К недостаткам замороженных срезов можно отнести плохую морфологию, низкое разрешение при больших увеличениях, сложность разрезания парафиновых срезов и необходимость хранения в замороженном виде. В качестве альтернативы, вибратом Срезы не требуют обработки ткани органическими растворителями или высокой температурой, которые могут разрушить антигенность, или нарушением замораживания-оттаивания. Недостатком вибратомных секций является то, что процесс секционирования медленный и трудный для мягких и плохо закрепленных тканей, и что на секциях часто видны следы вибрации или линии вибратома.

Обнаружение многих антигенов можно значительно улучшить, если: поиск антигена методы, которые действуют путем разрыва некоторых перекрестных связей белков, образованных фиксацией, для выявления скрытых антигенных сайтов. Это может быть достигнуто путем нагревания в течение разного времени (извлечение эпитопа, индуцированного нагреванием или HIER) или с использованием ферментативного расщепления (извлечение эпитопа, индуцированного протеолитами, или PIER).[4]

Одной из основных трудностей при окрашивании ИГХ является преодоление специфического или неспецифического фона. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация промывочных буферов и времени промывки после антител - все это важно для получения высококачественного иммуноокрашивания. Кроме того, наличие положительных и отрицательных контроль для окрашивания необходимы для определения специфичности.

Проточной цитометрии

Основная статья: Проточной цитометрии

А проточный цитометр может использоваться для прямого анализа клеток, экспрессирующих один или несколько конкретных белков. Клетки иммуноокрашивают в растворе с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для иммунофлуоресценции, а затем анализируют проточной цитометрией.

Проточная цитометрия имеет несколько преимуществ перед ИГХ, включая: способность определять отдельные популяции клеток по их размеру и гранулярности; способность удалять мертвые клетки; повышенная чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективной при обнаружении чрезвычайно редких популяций клеток, и при отсутствии среза ткани происходит потеря архитектурных отношений.[5] Проточная цитометрия также требует высоких капитальных затрат, связанных с покупкой проточного цитометра.

Вестерн-блоттинг

Основная статья: Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать определенные белки из экстрактов клеток или тканей до или после любого очищение шаги. Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофорез перед переводом в синтетический мембрана методами сухого, полусухого или влажного блоттинга. Затем мембрану можно исследовать с использованием антител, используя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Обнаружение обычно выполняется с помощью пероксидаза связанные антитела, чтобы катализировать хемилюминесцентный реакция.

Вестерн-блоттинг - это стандартный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка в экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет белку молекулярный вес быть измеренным по сравнению с известными маркерами молекулярной массы.

Иммуноферментный анализ

Основная статья: ELISA

Иммуноферментный анализ или ELISA - это диагностический метод для количественного или полуколичественного определения концентраций белка из плазма крови, сыворотка или экстракты клеток / тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В общем, белки в растворе адсорбируются на планшетах для ELISA. Антитела, специфичные для интересующего белка, используются для зондирования планшета. Фон сводится к минимуму за счет оптимизации методов блокирования и промывки (как для ИГХ), а специфичность обеспечивается за счет наличия положительных и отрицательных контролей. Методы обнаружения обычно основаны на колориметрии или хемилюминесценции.

Иммуно-электронная микроскопия

Основная статья: иммунная электронная микроскопия

Электронная микроскопия или ЭМ можно использовать для детального изучения микроархитектуры тканей или клеток. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золотом), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающая электронная микроскопия. Несмотря на то, что иммуно-ЭМ эффективен в обнаружении субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогим и требовать строгой оптимизации методов фиксации и обработки ткани. Протеин биотинилирование in vivo было предложено облегчить проблемы, вызванные частой несовместимостью окрашивания антител с протоколами фиксации, которые лучше сохраняют морфологию клеток.[6]

Методологический обзор

В методах иммуноокрашивания антитело используется для обнаружения конкретного белок эпитоп. Эти антитела могут быть моноклональный или же поликлональный. Обнаружение этого первого или первичное антитело может быть выполнено несколькими способами.

  • Первичное антитело можно пометить непосредственно с помощью фермент или же флуорофор.
  • Первичное антитело можно пометить с помощью небольшой молекулы, которая взаимодействует с партнером по связыванию с высоким сродством, который может быть связан с ферментом или флуорофором. В биотин-стрептавидин - одно из обычно используемых взаимодействий с высоким сродством.
  • Первичное антитело можно исследовать на предмет использования более широкого видоспецифичного вторичное антитело который маркируется с помощью фермента или флуорофора.
  • В случае электронная микроскопия, антитела связаны с частицами тяжелых металлов (обычно с наночастицами золота диаметром 5-15 нм).

Как описано ранее, ферменты, такие как хрен пероксидаза или же щелочная фосфатаза обычно используются для катализа реакций, которые дают окрашенный или хемилюминесцентный товар. Флуоресцентный молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентная микроскопия или же конфокальная микроскопия.

Приложения

Применения иммуноокрашивания многочисленны, но чаще всего используются в клиническая диагностика и лабораторное исследование.

Клинически ИГХ используется в гистопатология для диагностики конкретных видов рака на основе молекулярных маркеров.

В лабораторных исследованиях иммуноокрашивание может использоваться для множества применений, основанных на исследовании присутствия или отсутствия белка, его тканевого распределения, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Еноты, Альберт; Creech HJ; Джонс, Р. Н. (1941). «Иммунологические свойства антитела, содержащего флуоресцентную группу». Proc Soc Exp Biol Med. 47: 200–202.
  2. ^ Рамос-Вара, Дж. А. (2005). «Технические аспекты иммуногистохимии». Vet Pathol. 42 (4): 405–426. Дои:10.1354 / вп.42-4-405. PMID 16006601.
  3. ^ Иммуногистохимия Введение
  4. ^ AbD Serotec, Bio-Rad. «Совет IHC 1: Получение антигена - что делать PIER или HIER?». Антитела Bio-Rad (ранее AbD Serotec).
  5. ^ Чери, H (2004). «Применение проточной цитометрии и иммуногистохимии в диагностической гематопатологии». Архив патологии и лабораторной медицины. 128 (9): 1004–1022. Дои:10.1043 / 1543-2165 (2004) 128 <1004: AOFCAI> 2.0.CO; 2. PMID 15335254.
  6. ^ Viens, A .; Харпер, Ф .; Pichard, E .; Comisso, M .; Pierron, G .; Огрызко, В. (2008). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации конкретной изоформы белка». Журнал гистохимии и цитохимии. 56 (10): 911–919. Дои:10.1369 / jhc.2008.951624. ЧВК 2544619. PMID 18574249.