WikiDer > Ионно-полупроводниковое секвенирование

Ion semiconductor sequencing

Ионно-полупроводниковое секвенирование это метод Секвенирование ДНК на основе обнаружения ионы водорода которые выпущены во время полимеризация из ДНК. Это метод «секвенирования путем синтеза», в ходе которого дополнительный цепь построена на основе последовательности цепи матрицы.

Полупроводниковый секвенсор Ion Proton

Микролунка, содержащая матричную цепь ДНК, подлежащую секвенированию, заполняется одним видом дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP). Если введенный dNTP дополнительный к ведущему матричному нуклеотиду он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение иона водорода, который запускает ISFET ионный датчик, который указывает, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько молекул dNTP будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и пропорционально более высокому электронному сигналу.

Эта технология отличается от других последовательность действий-по-синтезы, в которых нет модифицированных нуклеотидов или оптика используются. Ионно-полупроводниковое секвенирование можно также называть секвенированием ионного потока, pH-опосредованным секвенированием, кремниевым секвенированием или полупроводниковым секвенированием.

История развития технологий

Технология была лицензирована у компании DNA Electronics Ltd,[1][2] разработан Ion Torrent Systems Inc. и выпущен в феврале 2010 года.[3] Компания Ion Torrent представила свою машину как быстрый, компактный и экономичный секвенсор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного устройства.[4] Роше 454 Науки о жизни сотрудничает с DNA Electronics в разработке платформы для долгого считывания полупроводников с высокой плотностью записи с использованием этой технологии.[5]

Технологии

подпись
Включение дезоксирибонуклеотидтрифосфата в растущую цепь ДНК вызывает высвобождение водорода и пирофосфата.
подпись
Высвобождение ионов водорода указывает, были ли включены ноль, один или несколько нуклеотидов.
подпись
Высвобожденные ионы водорода обнаруживаются ионным датчиком. Множественные включения приводят к соответствующему количеству выпущенных водородов и интенсивности сигнала.

Секвенирование химии

В природе включение дезоксирибонуклеозидтрифосфат (dNTP) в растущую цепь ДНК вовлекает образование Ковалентная связь и выпуск пирофосфат и положительно заряженный ион водорода.[1][3][6] DNTP будет включен только в том случае, если он дополнительный к ведущему неспаренному матричному нуклеотиду. Ионно-полупроводниковое секвенирование использует эти факты, определяя, высвобождается ли ион водорода при введении в реакцию одного вида dNTP.

Микролунки на полупроводниковый чип каждая из которых содержит множество копий одной одноцепочечной молекулы матричной ДНК, подлежащей секвенированию, и ДНК-полимераза последовательно залиты немодифицированными A, C, G или T dNTP.[3][7][8] Если введенный dNTP комплементарен следующему неспаренному нуклеотиду на матричной цепи, он включается в растущую комплементарную цепь ДНК-полимеразой.[9] Если введенный dNTP не является комплементарным, не происходит включения и биохимической реакции. Ион водорода, который выделяется в реакции, изменяет pH решения, которое обнаруживается ISFET.[1][3][7] Неприкрепленные молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда вводится другой вид dNTP.[7]

Обнаружение сигнала

Под слоем микролунок находится ионно-чувствительный слой, ниже которого находится ISFET ионный датчик.[4] Все слои содержатся в CMOS полупроводниковый чип, аналогичный тому, что используется в электронной промышленности.[4][10]

Каждый чип содержит набор микролунок с соответствующими ISFET детекторы.[7]Каждый выпущенный ион водорода затем запускает ISFET ионный датчик. Последовательность электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, преобразуется в последовательность ДНК без необходимости в промежуточном преобразовании сигнала.[7][11] Поскольку события включения нуклеотидов измеряются непосредственно электроникой, использование меченых нуклеотидов и оптических измерений избегается.[4][10] Затем обработка сигналов и сборка ДНК могут выполняться в программном обеспечении.

Характеристики секвенирования

Базовая точность, достигнутая компанией Ion Torrent на Ион Торрент Ионно-полупроводниковый секвенсор по состоянию на февраль 2011 г. составил 99,6% на основе 50 основание читает, со 100 Мб на прогон.[12] Длина чтения по состоянию на февраль 2011 г. составляла 100 пар оснований.[12] Точность для гомополимерных повторов длиной 5 повторов составила 98%.[12] Более поздние версии показывают длину чтения 400 пар оснований. [13] Эти цифры еще не прошли независимую проверку за пределами компании.

Сильные стороны

Основными преимуществами ионно-полупроводникового секвенирования являются высокая скорость секвенирования, а также низкие первоначальные и эксплуатационные расходы.[8][11] Это стало возможным благодаря отказу от модифицированных нуклеотидов и оптических измерений.

Поскольку система регистрирует естественные опосредованные полимеразой события включения нуклеотидов, секвенирование может происходить в режиме реального времени. В действительности скорость секвенирования ограничена циклической сменой субстрат нуклеотидов через систему.[14] Разработчик технологии Ion Torrent Systems Inc. утверждает, что каждое измерение включения занимает 4 секунды, а каждый запуск занимает около часа, в течение которого секвенируются 100-200 нуклеотидов.[11][15] Если полупроводниковые чипы улучшаются (как предсказывает Закон Мура), количество операций чтения на чип (и, следовательно, на прогон) должно увеличиться.[11]

Стоимость приобретения pH-опосредованного секвенатора от Ion Torrent Systems Inc. на момент запуска была оценена примерно в 50 000 долларов США, без учета оборудования для подготовки проб и сервера для анализа данных.[8][11][15] Стоимость одного цикла также значительно ниже, чем у альтернативных методов автоматического секвенирования, и составляет примерно 1000 долларов.[8][12]

Ограничения

Если гомополимер повторы одного и того же нуклеотида (например, TTTTT) присутствуют на шаблон прядь (цепь должна быть секвенирована), затем встраиваются несколько введенных нуклеотидов, и за один цикл высвобождается больше ионов водорода. Это приводит к большему изменению pH и пропорционально большему электронному сигналу.[11] Это ограничение системы в том, что трудно перечислить длинные повторы. Это ограничение характерно для других методов, которые обнаруживают добавление одиночных нуклеотидов, таких как пиросеквенирование.[16] Сигналы, генерируемые большим числом повторов, трудно отличить от повторов аналогичного, но другого числа; напримергоморепиты длиной 7 сложно отличить от гомореповторов длины 8.

Еще одним ограничением этой системы является малая длина чтения по сравнению с другими методами секвенирования, такими как Секвенирование по Сэнгеру или же пиросеквенирование. Более длинные чтения полезны для de novo сборка генома. Полупроводниковые секвенаторы Ion Torrent обеспечивают среднюю длину чтения примерно 400 нуклеотиды за чтение.[3][8]

Пропускная способность в настоящее время ниже, чем у других технологий секвенирования с высокой пропускной способностью, хотя разработчики надеются изменить это, увеличив плотность чип.[3]

Заявление

Разработчики полупроводникового секвенатора Ion Torrent представили его как быстрый, компактный и экономичный секвенсор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного устройства.[3][4] Компания надеется, что их система перенесет секвенирование за пределы специализированных центров в больницы и небольшие лаборатории.[17] Статья в New York Times за январь 2011 г. «Распространение секвенирования ДНК в массы», подчеркивает эти амбиции.[17]

Благодаря способности альтернативные методы секвенирования для достижения большей длины чтения (и, следовательно, более подходящей для анализ всего генома) эта технология может лучше всего подходить для небольших приложений, таких как микробный секвенирование генома, микробиологическое транскриптом секвенирование, целевое секвенирование, ампликон секвенирование, или для проверки качества библиотек секвенирования.[3][8][18]

Рекомендации

  1. ^ а б c Bio-IT World, Дэвис, К. Превентивная медицина. Мир биотехнологий 2011
  2. ^ GenomeWeb DNA Electronics лицензирует IP для Ion Torrent. Август 2010 г.
  3. ^ а б c d е ж грамм час Раск, Н. (2011). "Торренты последовательности". Нат Мет 8 (1): 44-44.
  4. ^ а б c d е Официальная веб-страница Ion Torrent В архиве 2012-11-06 в Wayback Machine.
  5. ^ GenomeWeb Компания «Рош» сотрудничает с компанией DNA Electronics, чтобы помочь в переходе платформы 454 на электрохимическое обнаружение. Ноябрь 2010 г.
  6. ^ Пурушотаман, S, Toumazou, C, Ou, C-P Обнаружение протонов и однонуклеотидного полиморфизма: простое использование ионно-чувствительного полевого транзистора
  7. ^ а б c d е Пенниси, Э (2010). «Полупроводники вдохновляют на создание новых технологий секвенирования». Наука. 327 (5970): 1190. Bibcode:2010Sci ... 327.1190P. Дои:10.1126 / science.327.5970.1190. PMID 20203024.
  8. ^ а б c d е ж Перкель, Дж., «Установление контакта с четвертым поколением секвенирования» В архиве 2013-12-27 в Wayback Machine. Биотехники, 2011.
  9. ^ Альбертс Б, Молекулярная биология клетки. 5-е изд. 2008, Нью-Йорк: Наука о гирляндах.
  10. ^ а б Кароу, Дж. (2009) Патентное приложение Ion Torrent предлагает технологию секвенирования с использованием чувствительных к химическим веществам полевых транзисторов. В последовательности.
  11. ^ а б c d е ж Bio-IT World, Дэвис, К. Это "Ватсон встречает Мура", поскольку Ion Torrent представляет Semiconductor Sequencing. Bio-IT World 2010.
  12. ^ а б c d Кароу, Дж. (2009) В AGBT клиенты Ion Torrent предоставляют первую обратную связь; Life Tech описывает рост платформы. В последовательности.
  13. ^ [1]
  14. ^ Ид, Дж. И др., «Секвенирование ДНК в реальном времени по отдельным молекулам полимеразы». Science, 2009. 323 (5910): с. 133-8.
  15. ^ а б Кароу, Дж. (2010) Ion Torrent Systems представляет электронный секвенсор стоимостью 50 000 долларов на выставке AGBT. В последовательности.
  16. ^ Мецкер, М.Л., «Новые технологии в секвенировании ДНК». Genome Res, 2005. 15 (12): p. 1767-76.
  17. ^ а б Поллак, А., Распространение секвенирования ДНК в массыв New York Times. 2011: Нью-Йорк.
  18. ^ Chiosea, SI; Уильямс, L; Гриффит, СС; Томпсон, ЛД; Вайнреб, я; Bauman, JE; Luvison, A; Рой, S; Seethala, RR; Никифорова, М.Н. (июнь 2015). «Молекулярная характеристика рака апокринного слюнного протока». Американский журнал хирургической патологии. 39 (6): 744–52. Дои:10.1097 / па.0000000000000410. PMID 25723113. S2CID 34106002.

внешняя ссылка