WikiDer > Молекулярный маяк

Molecular beacon
Структура молекулярных маяков в их нативных конформациях (вверху) или гибридизированных с цепью ДНК (внизу)

Молекулярные маяки, или же зонды молекулярных маяков, находятся олигонуклеотид зонды гибридизации которые могут сообщить о наличии определенных нуклеиновые кислоты в гомогенных растворах. Молекулярные маяки заколка для волос-образные молекулы с внутренним закаленный флуорофор чей флуоресценция восстанавливается, когда они связываются с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Это роман не-радиоактивный метод обнаружения специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Они полезны в ситуациях, когда невозможно или нежелательно изолировать гибриды зонд-мишень от избытка гибридизационных зондов.

Молекулярные зонды-маяки

Структура типичного зонда с молекулярным маяком

Типичный датчик молекулярного маяка - 25 нуклеотиды длинный.[нужна цитата] Средние 15 нуклеотидов комплементарны мишени. ДНК или РНК и не образуют пары оснований друг с другом, в то время как пять нуклеотидов на каждом конце комплементарны друг другу, а не целевой ДНК. Типичную структуру молекулярного маяка можно разделить на 4 части: 1) петля, область из 18-30 пар оснований молекулярного маяка, которая комплементарна целевой последовательности; 2) стержень, образованный прикреплением к обоим концам петли двух коротких (от 5 до 7 нуклеотидных остатков) олигонуклеотидов, комплементарных друг другу; 3) 5 'флуорофор на 5' конце молекулярного маяка, ковалентно присоединен флуоресцентный краситель; 4) 3'-гаситель (нефлуоресцентный) краситель, ковалентно присоединенный к 3'-концу молекулярного маяка. Когда маяк имеет форму замкнутого контура, гаситель находится рядом с флуорофором, что приводит к гашению флуоресцентного излучения последнего.

Если обнаруживаемая нуклеиновая кислота комплементарна цепи в петле, событие гибридизация происходит. Дуплекс, образованный между нуклеиновой кислотой и петлей, более стабилен, чем дуплекс стебля, поскольку первый дуплекс включает больше пар оснований. Это вызывает разделение стержня и, следовательно, флуорофора и гасителя. Как только флуорофор больше не находится рядом с гасителем, освещение гибрида светом приводит к флуоресцентному излучению. Наличие испускания сообщает, что событие гибридизации произошло и, следовательно, последовательность нуклеиновой кислоты-мишени присутствует в тестируемом образце.

Синтез

Основная статья: Синтез олигонуклеотидов

Молекулярные маяки синтетический олигонуклеотиды подготовка которых хорошо задокументирована. В дополнение к обычному набору нуклеозид фосфорамидиты, для синтеза также требуется твердая подложка, модифицированная гасителем, и строительный блок из фосфорамидита, предназначенный для присоединения защищенного флуоресцентного красителя.

Первое использование термина молекулярные маяки, синтез и демонстрация функции было в 1996 году.[1]

Альтернативные технологии гомогенного анализа

  • Анализ 5'-нуклеазы TaqMan[2]
  • Экситон-контролируемые чувствительные к гибридизации флуоресцентные олигонуклеотидные зонды (ECHO).[3]
  • Зонды для двойной гибридизации (LightCycler®)
  • Зонды Scorpions®
  • Датчики LUX (Light при расширении)
  • Анализ связывания ДНК с красителем (например, SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus и т. Д.)

Приложения

  • Обнаружение SNP[2]
  • Обнаружение нуклеиновых кислот в реальном времени
  • Количественная оценка ПЦР в реальном времени
  • Аллельная дискриминация и идентификация[2]
  • Мультиплексные ПЦР-анализы
  • Диагностические клинические тесты

Рекомендации

  1. ^ Тяги S; Крамер FR (1996). «Молекулярные маяки: зонды, флуоресцирующие при гибридизации». Nat. Биотехнология. 14 (3): 303–8. Дои:10.1038 / nbt0396-303. PMID 9630890. S2CID 27010207.
  2. ^ а б c Täpp I; Malmberg L; Rennel E; Wik M; и другие. (Апрель 2000 г.). «Гомогенная оценка однонуклеотидных полиморфизмов: сравнение 5'-нуклеотидного анализа TaqMan и зондов Molecular Beacon». Биотехнологии. 28 (4): 732–8. Дои:10.2144 / 00284rr02. PMID 10769752.
  3. ^ Акимицу Окамото (2011). «Зонды ECHO: концепция контроля флуоресценции для практического определения нуклеиновых кислот». Chem. Soc. Rev. 40 (12): 5815–5828. Дои:10.1039 / c1cs15025a. PMID 21660343.