WikiDer > Сайт множественного клонирования - Википедия

Multiple cloning site - Wikipedia
Вектор клонирования pUC19, показывающий последовательность множественных сайтов клонирования с сайтами рестрикционных ферментов.

А сайт множественного клонирования (MCS), также называемый полилинкер, это короткий отрезок ДНК который содержит много (до ~ 20) сайты ограничения - стандартная функция инженерных плазмиды.[1] Сайты рестрикции в MCS обычно уникальны и встречаются только один раз в данной плазмиде. Цель MCS в плазмиде - позволить фрагменту ДНК быть вставленным в эту область.[2] MCS встречается в различных векторах, включая клонирование векторов для увеличения количества копий целевой ДНК, а в векторы экспрессии для создания белкового продукта.[3] В экспрессионных векторах MCS располагается ниже по течению от промоутер.[2]

Создание сайта множественного клонирования

В некоторых случаях вектор может не содержать MCS. Скорее, к вектору можно добавить MCS.[4] Первый шаг - проектирование дополнительных олигонуклеотид последовательности, содержащие рестрикционный фермент сайты вместе с дополнительными основаниями на конце, которые комплементарны вектору после переваривания. Затем олигонуклеотидные последовательности могут быть отожжены и лигированы в расщепленный и очищенный вектор. Расщепленный вектор разрезают рестрикционным ферментом, который дополняет выступающие части олигонуклеотидной вставки. После лигирования трансформируйте вектор в бактерии и проверьте вставку путем секвенирования. Этот метод также можно использовать для добавления новых сайтов ограничения к сайту множественного клонирования.

Диаграмма, показывающая процесс вставки сайта множественного клонирования в плазмидный вектор.

Использует

Множественные сайты клонирования - это функция, которая позволяет вставлять чужеродную ДНК без разрушения остальной плазмиды, что делает ее чрезвычайно полезной в биотехнология, биоинженерия, и молекулярная генетика.[1] MCS может помочь в создании трансгенных организмов, более известных как генетически модифицированный организм (ГМО) с помощью генной инженерии. Чтобы воспользоваться преимуществами MCS в генной инженерии, интересующий ген должен быть добавлен к вектору во время производства, когда MCS разрезана.[5] После создания и лигирования MCS он будет включать интересующий ген и может быть амплифицирован для увеличения числа копий гена в бактерии-хозяине. После того, как бактерия реплицируется, интересующий ген может быть извлечен из бактерии. В некоторых случаях экспрессионный вектор можно использовать для создания белкового продукта. После того, как продукты изолированы, они имеют широкий спектр применения, например, производство инсулин, создание вакцина, изготовление антибиотики, и создание генных терапий.

Пример

Одна бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии в качестве вектора клонирования плазмиды, - это pUC18. Его полилинкерная область состоит из нескольких сайтов узнавания рестрикционных ферментов, которые были сконструированы в единый кластер (полилинкер). Он имеет сайты рестрикции для различных ферментов рестрикции, включая EcoRI, BamHI, и PstI. Другой вектор, используемый в генной инженерии, - это pUC19, который похож на pUC18, но его полилинкерная область инвертирована. Кишечная палочка также обычно используется в качестве бактериального хозяина из-за доступности, быстрой скорости роста и универсальности.[6]

Для того чтобы генетически сконструировать инсулин, первым делом необходимо разрезать MCS в используемой плазмиде.[7] Как только MCS разрезан, можно добавить ген человеческого инсулина, сделав плазмиду генетически модифицированной. После этого генетически модифицированная плазмида помещается в бактериальный хозяин и дается возможность делиться. Чтобы обеспечить необходимый запас, клетки-хозяева помещают в большой резервуар для ферментации, который является оптимальной средой для хозяина. Процесс завершается отфильтровыванием инсулина от хозяина. Затем можно произвести очистку, чтобы инсулин можно было упаковать и распределить среди людей с диабетом.

Рекомендации

  1. ^ а б Кларк Д.П. (2005). Молекулярная биология. Академическая пресса. п. 611. ISBN 0-12-175551-7.
  2. ^ а б "Addgene: Что такое плазмид?". www.addgene.org. Получено 2018-04-29.
  3. ^ Картер, Ши, Мэтт, Дженнифер (2015). Руководство по методам исследования в неврологии. Эльзевир. С. 219–237.
  4. ^ «Как создать идеальную MCS» (PDF). Addgene. 2018-04-28.
  5. ^ "BBC - Биология Bitesize Standard Grade - Перепрограммирование микробов: пересмотр, стр. 2". Получено 2018-04-29.
  6. ^ "Инструменты генной инженерии | Безграничная микробиология". course.lumenlearning.com. Получено 2018-04-29.
  7. ^ "Что такое генная инженерия?". Получено 2018-04-29.