WikiDer > Отпечаток пептидной массы

Peptide-mass fingerprint

В биоинформатика, а отпечаток пептидной массы или же карта пептидных масс это масс-спектр смеси пептиды что происходит из переваренного белок анализируется. Масс-спектр служит отпечатком пальца в том смысле, что это образец, который может служить для идентификации белка.[1] Метод формирования отпечатка пептидной массы, разработанный в 1993 году, состоит из выделения белка, разбиения его на отдельные пептиды и определения масс пептидов с помощью некоторой формы масс-спектрометрии.[2] После формирования отпечаток пептидной массы можно использовать для поиска в базах данных родственного белка или даже геномных последовательностей, что делает его мощным инструментом для аннотации генов, кодирующих белок.[3]

Одним из основных преимуществ массового снятия отпечатков пальцев является то, что его выполнять значительно быстрее, чем пептидное секвенирование, но результаты одинаково полезны.[4] К недостаткам можно отнести необходимость единственного белка для анализа и требование, чтобы последовательность белка располагалась, по крайней мере, со значительной гомологией, в базе данных. Поскольку масса отдельных пептидов измеряется при формировании отпечатка пальца, смеси различных белков могут давать ненадежные результаты. Таким образом, подготовка проб - важный шаг в этом процессе. Даже в этом случае, если получены надежные результаты, в базе данных, которую вы ищете, должна быть соответствующая пептидная последовательность, чтобы результаты были полезными.[5]

Базовые приготовления

SDS-PAGE гель-электрофорез

Перед анализом с помощью масс-спектрометрии белок должен быть точно выделен и расщеплен. Если не изолировать, результаты будут представлять собой смесь двух или более белков и, следовательно, будут ненадежными при идентификации белков. Из-за этой чувствительности подготовка образца, вероятно, является наиболее важным шагом в формировании отпечатка пальца пептидной массы.

Выделение определенного белка чаще всего осуществляется с помощью гель-электрофорез, в котором белки разделены по размеру и впоследствии могут быть экстрагированы для дальнейшего приготовления. Однако их также можно изолировать жидкостная хроматография. Этот метод также разделяет белки по размеру.[6]

После выделения отдельного белка его необходимо переварить и фракционировать для дальнейшего анализа с помощью спектрометра. Это достигается путем добавления протеолитических ферментов, таких как трипсин и химотрипсин.[7]

Другой широко используемый метод, который сочетает в себе этапы выделения и переваривания, - это SDS-СТРАНИЦА, форма электрофореза, при которой белки разделяются и фракционируются одновременно.

Спектрометрический анализ

Расщепленный белок можно анализировать с помощью различных типов масс-спектрометров, таких как ESI-TOF или же МАЛДИ-ТОФ. MALDI-TOF часто является предпочтительным прибором, поскольку он обеспечивает высокую пропускную способность и позволяет анализировать несколько белков в одном эксперименте, если дополнить его МС / МС анализ.[8]

Пример масс-спектра

В матричной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) фрагментированный образец пептида загружается на матрицу и ионизируется с помощью лазера высокой энергии. Затем фрагментированные ионы разделяются по соотношению массы к заряду на основе время полета (TOF) через спектрометр. Затем они могут быть далее фрагментированы и повторно проанализированы с помощью тандемной масс-спектрометрии, часто с квадрупольная ионная ловушка,[9] но также возможно с тандемным временем полета.[10]

Выходные данные, полученные с масс-спектрометра, представлены в виде списка пиков. Этот спектр показывает массы и относительные содержания пептидных фрагментов, присутствующих в образце. При чтении спектра, подобного показанному, необходимо учитывать все возможные основные фрагментации белка. Тогда массы этих фрагментов коррелируют с числами в пиках спектра. Хотя он может быть проанализирован до некоторой степени сам по себе, при формировании «отпечатка пальца» пептидной массы список пиков проходит через поиск в базе данных, чтобы найти гомологичные пептидные последовательности.

Компьютерный анализ базы данных

Список пиков, полученный с помощью спектрометрических средств, используется в качестве запроса при поиске в базе данных с помощью программного обеспечения. ТАЛИСМАН.[11] Программное обеспечение MASCOT использует алгоритм, который ищет значительную гомологию пептидной последовательности для представления наиболее статистически вероятного белка в образце на основе результатов.

Выполняя поиск, вы выбираете базу данных для просмотра. Такие базы данных включают, среди прочего, Swissprot, часто используемый при исследовании хорошо охарактеризованных организмов, таких как люди, мыши и дрожжи; и NCBInr для более общего и надежного поиска.

Подробное руководство по использованию программы MASCOT можно найти по ссылке ниже.

Приложения

Использование отпечатка пальца пептидной массы довольно широко распространено в протеомных исследованиях. Вот некоторые конкретные примеры его использования в полевых условиях:

Скрининг и характеристика активности амилазы и целлюлазы у психротолерантных дрожжей

Авторы этого исследования стремились определить, какие дрожжи были метаболически активными при более низких температурах и, следовательно, могли использоваться для более холодных промышленных процессов. Они выращивали различные дрожжи на среде при разных температурах, а затем определяли активность ферментов, разделяя белки на геле и снимая отпечатки пальцев с отдельных полос. Путем поиска в базе данных они нашли интересующий фермент и обнаружили два отдельных дрожжевых грибка, которые имели более высокую активность при более низких температурах.[12]

APOA-I: возможный новый биомаркер метаболических побочных эффектов при первом эпизоде ​​шизофрении

Авторы этого исследования стремились определить влияние препарата рисперидон на метаболизм у больных шизофренией. Обнаружив, что рисперидон действительно имеет отрицательные метаболические побочные эффекты, они протестировали мембранные белки для транспорта глюкозы и липидов в контрольной и экспериментальной группах с помощью MALDI-TOF и снятия отпечатков пальцев. Результаты показали изменение отпечатков пальцев и, следовательно, изменение уровней сворачивания белков. Таким образом, они пришли к выводу, что рисперидон отрицательно влияет на белки транспорта глюкозы и липидов в клеточных мембранах пациентов.[13]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Масс-спектрометрия в биологических науках
  2. ^ James, P .; Quadroni, M .; Carafoli, E .; Гонне, Г. (1993-08-31). «Идентификация белков по отпечаткам пальцев массового профиля». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 195 (1): 58–64. Дои:10.1006 / bbrc.1993.2009. ISSN 0006-291X. PMID 8363627.
  3. ^ Коттрелл, Дж. С. (1994-06-01). «Идентификация белка по отпечатку пептидной массы». Пептидные исследования. 7 (3): 115–124. ISSN 1040-5704. PMID 8081066.
  4. ^ Паппин, Д. Дж .; Hojrup, P .; Близби, А. Дж. (1 июня 1993 г.). «Быстрая идентификация белков путем снятия отпечатков пальцев по массе пептидов». Текущая биология. 3 (6): 327–332. Дои:10.1016 / 0960-9822 (93) 90195-т. ISSN 0960-9822. PMID 15335725. S2CID 40203243.
  5. ^ Хензель, Уильям Дж; Ватанабэ, Колин; Stults, Джон Т. (2003-09-01). «Идентификация белков: истоки дактилоскопии пептидных масс». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 14 (9): 931–942. Дои:10.1016 / S1044-0305 (03) 00214-9. PMID 12954162.
  6. ^ «Узел EMBnet в Швейцарии» (PDF). www.ch.embnet.org. Получено 2016-04-11.
  7. ^ Yates, J. R .; Speicher, S .; Griffin, P.R .; Хункапиллер, Т. (1993-11-01). «Массовые карты пептидов: высокоинформативный подход к идентификации белков». Аналитическая биохимия. 214 (2): 397–408. Дои:10.1006 / abio.1993.1514. ISSN 0003-2697. PMID 8109726.
  8. ^ Йетс, Дж. Р. (1 января 1998 г.). «Масс-спектрометрия и возраст протеома». Журнал масс-спектрометрии. 33 (1): 1–19. Дои:10.1002 / (SICI) 1096-9888 (199801) 33: 1 <1 :: AID-JMS624> 3.0.CO; 2-9. ISSN 1076-5174. PMID 9449829.
  9. ^ Ахмед, Фарид Э. (2008-12-01). «Применение масс-спектрометрии для протеомного анализа: часть I. Концептуальные и экспериментальные подходы». Экспертный обзор протеомики. 5 (6): 841–864. Дои:10.1586/14789450.5.6.841. ISSN 1744-8387. PMID 19086863. S2CID 38574652.
  10. ^ Вестал, Марвин Л .; Кэмпбелл, Дженнифер М. (01.01.2005). Тандемная времяпролетная масс-спектрометрия. Методы в энзимологии. 402. С. 79–108. Дои:10.1016 / S0076-6879 (05) 02003-3. ISBN 9780121828073. ISSN 0076-6879. PMID 16401507.
  11. ^ Райт, Джеймс С.; Коллинз, Марк О .; Ю, Лу; Келл, Лукас; Брош, Маркус; Чоудхари, Джоти С. (01.08.2012). «Улучшенная идентификация пептидов путем диссоциации с переносом электрона с использованием улучшенного перколятора Mascot». Молекулярная и клеточная протеомика. 11 (8): 478–491. Дои:10.1074 / mcp.O111.014522. ISSN 1535-9484. ЧВК 3412976. PMID 22493177.
  12. ^ Карраско, Марио; Вильярреал, Пабло; Бараона, Сальвадор; Алькаино, Дженнифер; Сифуэнтес, Виктор; Баэса, Марсело (19 февраля 2016 г.). «Скрининг и характеристика активности амилазы и целлюлазы в психротолерантных дрожжах». BMC Microbiology. 16: 21. Дои:10.1186 / s12866-016-0640-8. ISSN 1471-2180. ЧВК 4759947. PMID 26895625.
  13. ^ Сун, Сюэцинь; Ли, Сюэ; Гао, Цзиньсонг; Чжао, Цзинпин; Ли, Юхуэй; Фань, Сяодуо; Львов, Луксиан (07.04.2014). «APOA-I: возможный новый биомаркер метаболических побочных эффектов при первом эпизоде ​​шизофрении». PLOS ONE. 9 (4): e93902. Дои:10.1371 / journal.pone.0093902. ISSN 1932-6203. ЧВК 3978061. PMID 24710015.

внешняя ссылка