WikiDer > Секвенирование полонии

Polony sequencing

Секвенирование полонии недорогой, но очень точный метод мультиплексного секвенирования которые можно использовать для параллельного «чтения» миллионов иммобилизованных последовательностей ДНК. Этот метод был впервые разработан Доктор Джордж Черчгруппа в Гарвардская медицинская школа. В отличие от других методов секвенирования, Полония Технология секвенирования - это открытая платформа со свободно загружаемым программным обеспечением и протоколами с открытым исходным кодом. Кроме того, аппаратное обеспечение этого метода можно легко настроить с помощью общедоступных эпифлуоресцентная микроскопия и управляемая компьютером проточная ячейка / жидкостная система. Секвенирование полонии обычно выполняется на парные конечные теги В библиотеке говорится, что каждая молекула ДНК-матрицы имеет длину 135 п.н. с двумя парными геномными тегами 17–18 п.н., разделенными и фланкированными общими последовательностями. Текущая длина чтения этого метода составляет 26 оснований на ампликон и 13 оснований на тег, оставляя промежуток в 4–5 оснований в каждом теге.

Рабочий процесс

Иллюстрированная процедура секвенирования полонии

Протокол секвенирования Polony можно разбить на три основных части: создание библиотеки парных концевых тегов, амплификация матрицы и секвенирование ДНК.

Создание библиотеки парных конечных тегов

Этот протокол начинается со случайного разрезания тестируемой геномной ДНК до плотного распределения по размерам. Срезанные молекулы ДНК затем подвергаются репарации концов и обработке A-хвоста. Обработка репарации концов преобразует любые поврежденные или несовместимые выступающие концы ДНК в 5’-фосфорилированную ДНК с тупыми концами, обеспечивая немедленное лигирование тупых концов, в то время как обработка A-хвоста добавляет A к 3 ’конца разрезанной ДНК. Молекулы ДНК длиной 1 т.п.н. отбирают путем нанесения на 6% гель TBE PAGE. На следующем этапе молекулы ДНК подвергаются циркуляризации с помощью синтетических олигонуклеотидов длиной 30 п.н. с Т-образным хвостом (T30), которые содержат два обращенных наружу сайта узнавания MmeI, и полученная кольцевая ДНК подвергается репликация катящегося круга. Затем амплифицированные циркуляризованные молекулы ДНК переваривают MmeI (эндонуклеазой рестрикции типа II), которая разрезает на расстоянии от своего сайта узнавания, высвобождая фрагмент Т30, фланкированный тегами 17-18 п.н. (длина ≈70 п.н.). Молекулы с парными метками необходимо отремонтировать до лигирования праймерных олигонуклеотидов ePCR (эмульсионной ПЦР) (FDV2 и RDV2) к их обоим концам. Полученные в результате молекулы библиотеки 135 п.н. выбирают по размеру и ник перевел. Наконец, амплифицируйте молекулы библиотеки парных концевых меток длиной 135 п.н. ПЦР для увеличения количества библиотечного материала и устранения посторонних продуктов лигирования за один шаг. Полученная ДНК-матрица состоит из последовательности FDV размером 44 п.н., проксимальной метки 17-18 п.о., последовательности Т30, дистальной метки 17-18 п.о. и последовательности RDV 25 п.н.

Усиление шаблона

Эмульсионная ПЦР

Моноразмерный парамагнитный стрептавидин-Покрытые гранулы предварительно загружены двойным биотиновым прямым праймером. Стрептавидин имеет очень сильную привязанность к биотин, таким образом, передний праймер прочно приклеится к поверхности валиков. Затем готовят водную фазу с предварительно загруженными шариками, смесью ПЦР, прямым и обратным праймерами и библиотекой парных концевых тегов. Его смешивают и встряхивают с масляной фазой для создания эмульсии. В идеале каждая капля воды в масляной эмульсии содержит одну гранулу и одну молекулу матричной ДНК, что позволяет проводить миллионы невзаимодействующих амплификаций в миллилитровом объеме с помощью ПЦР.

Разрушение эмульсии

После амплификации эмульсию с предыдущего этапа разрушают с использованием изопропанола и детергентного буфера (10 мМ Трис pH 7,5, 1 мМ EDTA pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1% (об. / Об.) Тритон X-100, 1% (мас. / Об.) ) SDS), после чего следует серия встряхивания, центрифугирования и магнитной сепарации. Полученный раствор представляет собой суспензию пустых, клональных и неклональных гранул, которые возникают из капель эмульсии, которые изначально содержат ноль, одну или несколько молекул матрицы ДНК соответственно. На следующем этапе амплифицированный шарик может быть обогащен.

Обогащение бисером

Обогащение усиленных гранул достигается за счет гибридизации с более крупными немагнитными гранулами низкой плотности. полистирол шарики, которые предварительно загружены биотинилированными олигонуклеотидами для захвата (последовательность ДНК, комплементарная последовательности ампликона ePCR). Затем смесь центрифугируют, чтобы отделить комплекс амплифицированных и захватывающих гранул от неамплифицированных гранул. Амплифицированный комплекс улавливающих шариков имеет более низкую плотность и, таким образом, останется в супернатанте, в то время как неамплифицированные шарики образуют осадок. Супернатант собирают и обрабатывают NaOH, который разрушает комплекс. Парамагнитные усиленные шарики отделяются от немагнитных шариков захвата посредством магнитного разделения. Этот протокол обогащения позволяет в пять раз обогатить амплифицированные гранулы.

Укупорка бусинок

Целью кэппинга гранул является присоединение «кэпирующего» олигонуклеотида к 3’-концу как непротяженных прямых праймеров ePCR, так и сегмента RDV матричной ДНК. Используемый колпачок представляет собой аминогруппу, которая предотвращает лигирование флуоресцентных зондов с этими концами и в то же время способствует последующему связыванию матричной ДНК с покровным стеклом аминосилановой проточной кюветы.

Покровное стекло

Во-первых, покровные стекла промываются и обрабатываются аминосиланом, что обеспечивает последующее ковалентное связывание матричной ДНК на нем и устраняет любое флуоресцентное загрязнение. Усиленные, обогащенные шарики смешивают с акриламидом и выливают в неглубокую форму, образованную Тефлонпредметное стекло микроскопа. Немедленно поместите обработанное аминосиланом покровное стекло поверх акриламидного геля и дайте ему полимеризоваться в течение 45 минут. Затем переверните стопку слайдов / покровных стекол и извлеките предметные стекла из геля. Покровные стекла, обработанные силаном, будут ковалентно связываться с гелем, в то время как тефлон на поверхности предметного стекла микроскопа позволит лучше удалить предметное стекло из акриламидного геля. Затем покровные стекла прикрепляются к корпусу проточной кюветы, а все незакрепленные гранулы удаляются.

Секвенирование ДНК

Биохимия секвенирования полонии в основном основана на дискриминационные способности лигаз и полимеразы. Сначала серия якорных праймеров пропускается через клетки и гибридизируется с синтетическими олигонуклеотидными последовательностями на непосредственном 3 ’или 5’ конце проксимальных или дистальных геномных тегов геномной ДНК длиной 17-18 п.н. Затем проводят ферментативную реакцию лигирования якорного праймера с популяцией вырожденный нонамеры помечены флуоресцентными красителями.
Дифференциально помеченные нонамеры:

5 'Cy5 ‐ NNNNNNNNT
5 'Cy3 ‐ NNNNNNNNA
5 'ТехасРед ‐ NNNNNNNNC
5 '6FAM ‐ NNNNNNNNG

Меченые флуорофором нонамеры отжиг с дифференциальным успехом для последовательностей тегов в соответствии со стратегией, аналогичной стратегии вырожденные праймеры, но вместо того, чтобы подчиняться полимеразам, нонамеры селективно лигируются с прилегающей ДНК - якорным праймером. Фиксация молекулы флуорофора обеспечивает флуоресцентный сигнал, который указывает, есть ли A, C, G или T в позиции запроса на теге геномной ДНК. После четырехцветной визуализации комплексы якорный праймер / нонамер удаляются, и начинается новый цикл путем замены якорного праймера. Вводится новая смесь флуоресцентно меченных нонамеров, для которой позиция запроса смещается на одно основание дальше в геномную ДНК-метку. 

5 'Cy5 ‐ NNNNNNNTN
5 'Cy3 ‐ NNNNNNNAN
5 'ТехасРед ‐ NNNNNNNCN
5 '6FAM ‐ NNNNNNNGN

Таким способом можно запросить семь оснований с 5 ’к 3’ направлениям и шесть оснований с 3 ’конца. Конечным результатом является длина чтения 26 баз за прогон (13 баз для каждого из парных тегов) с промежутком от 4 до 5 баз в середине каждого тега.

Анализ и программное обеспечение

Секвенирование полонии генерирует миллионы 26 чтений за цикл, и эту информацию необходимо нормализовать и преобразовать в последовательность. Это можно сделать с помощью программного обеспечения, разработанного Church Lab. Все программное обеспечение бесплатное и может быть загружено с веб-сайта.[1]

Инструменты

Инструмент секвенирования, используемый в этой методике, может быть настроен с помощью широко доступного флуоресцентного микроскопа и проточной ячейки, управляемой компьютером. Необходимые инструменты стоили около 130 000 долларов США в 2005 году.[нужна цитата] Специальная машина для секвенирования полонии, Полонатор, был разработан в 2009 году и продан за 170 000 долларов США компанией Дувр.[2][3] Он включал в себя программное обеспечение с открытым исходным кодом, реагенты и протоколы и был предназначен для использования в Персональный проект генома.[4]

Сильные и слабые стороны

Секвенирование полонии обеспечивает высокую пропускную способность и высокую согласованную точность секвенирования ДНК на основе общедоступного недорогого инструмента. Кроме того, это очень гибкий метод, который позволяет применять переменные, включая BAC (бактериальная искусственная хромосома) и повторное секвенирование бактериального генома, а также SAGE (последовательный анализ экспрессии генов) тегов и секвенирование штрих-кода. Более того, метод секвенирования полонии подчеркивается как открытая система, которая использует все, включая разработанное программное обеспечение, протокол и реагенты.

Однако, хотя сбор необработанных данных может достигать 786 гигабит, полезен только 1 бит информации из 10 000 собранных бит. Другой проблемой этого метода является однородность относительного усиления отдельных мишеней. Неоднородная амплификация может снизить эффективность секвенирования и считается самым большим препятствием для этого метода.

История

Секвенирование полонии - это развитие полония технологии конца 1990-х и 2000-х годов.[5] В 2003 году были разработаны методы секвенирования на месте polonies, использующие одноосновное расширение, которое может достигать 5-6 базовых чтений.[6] К 2005 году эти ранние попытки были пересмотрены, чтобы разработать существующую технологию секвенирования полонии.[7] Высоко параллельные концепции секвенирования путем лигирования полонии стали основой для более поздних технологий секвенирования, таких как ABI Solid Sequencing.

использованная литература

  1. ^ «Секвенирование с открытым исходным кодом». arep.med.harvard.edu. Получено 2017-09-17.
  2. ^ «После фазы раннего доступа обновленный Polonator готов к развертыванию с ценой в 170 тысяч долларов». GenomeWeb. 2009-05-05. Получено 2017-09-17.
  3. ^ "Полонатор Дувра не затронут реструктуризацией Данахера, по официальным данным". GenomeWeb. 2009-09-08. Получено 2017-09-17.
  4. ^ "Полонатор". 2015-04-03. Архивировано из оригинал на 2015-04-03. Получено 2017-09-17.
  5. ^ Adessi, C .; Matton, G .; Ayala, G .; Turcatti, G .; Mermod, J. J .; Mayer, P .; Кавасима, Э. (2000-10-15). «Твердофазная амплификация ДНК: характеристика механизмов прикрепления праймеров и амплификации». Исследования нуклеиновых кислот. 28 (20): E87. Дои:10.1093 / nar / 28.20.e87. ISSN 1362-4962. ЧВК 110803. PMID 11024189.
  6. ^ Шендуре, Джей; Поррека, Грегори Дж .; Реппас, Никос Б .; Линь, Сяося; McCutcheon, John P .; Rosenbaum, Abraham M .; Ван, Майкл Д .; Чжан, Кун; Митра, Роби Д. (9 сентября 2005 г.). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука. 309 (5741): 1728–1732. Дои:10.1126 / science.1117389. ISSN 0036-8075. PMID 16081699.
  7. ^ Шендуре, Джей; Поррека, Грегори Дж .; Реппас, Никос Б .; Линь, Сяося; McCutcheon, John P .; Rosenbaum, Abraham M .; Ван, Майкл Д .; Чжан, Кун; Митра, Роби Д. (9 сентября 2005 г.). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука. 309 (5741): 1728–1732. Дои:10.1126 / science.1117389. ISSN 0036-8075. PMID 16081699.

внешние ссылки