WikiDer > Polymerase-Kettenreaktion
Das Polymerase Kettenreaktion[1] (PCR, von Polymerase Kettenreaktion), ist eine Möglichkeit, aus sehr kleinen Mengen zu extrahieren DNA (einzelne Basen), um eine oder mehrere Einheiten spezifisch zu multiplizieren (amplifizieren), bis genug davon zur Analyse vorhanden ist.
Es ist möglich, kurze DNA-Stücke, zum Beispiel 10 oder 12 Basen, nach herkömmlichen Methoden zu synthetisieren, aber für längere Stücke sind die verwendeten chemischen Reaktionen nicht spezifisch genug: bei längeren Stücken immer mehr falschSequenzen Die Polymerase-Kettenreaktion kann dieses Problem lösen, indem ein Problem verwendet wird Enzym das gewährleistet, dass ein DNA-Strang von sehr hoher Qualität hergestellt wird. Dies ist jedoch nicht so einfach, denn:
- Um ein Stück DNA zu bauen, verwendet dieses Enzym eine Proben-DNA. Das muss also erstmal da sein.
- Das Enzym braucht einen kleinen Start.
Anwendungen
- Bei vielen Infektionskrankheiten ist PCR zum Nachweis des Erregers möglich, PCR ist positiver als Serologie und liefert schnellere Ergebnisse als a wachsen. Beispiele: Parasiten, Keuchhusten, Tuberkulose. Auch die überwiegende Mehrheit der die Tests auf das Virus SARS-CoV-2, Welche COVID-19 durch PCR verursacht.
- Ein Biologe oder Biochemiker möchte oft ein Stück DNA aus einem bestehenden Organismus (oder etwas sehr Ähnlichem) vermehren. Als Beispiel kann das Original dienen.
- An einer gerichtsmedizinische Untersuchung man findet das Beispiel (zB einen Blutfleck) am Tatort.
- In der Authentizitätsforschung von Lebensmitteln wird die Technik zum Nachweis gentechnisch veränderter Organismen (gmo) zeigen.
Der kleine Anfang kann nach der traditionellen Methode gemacht werden, wenn man weiß, wo die gewünschte DNA-Sequenz beginnt und endet. Diese Stücke heißen Grundierungen.
So funktioniert die Reaktion
Die Reaktion besteht aus drei Phasen:
- Denaturierung: während dieser Phase die gesamte DNA, die ist dimer in der Lösung vorhanden ist, gespalten durch eine erhöhte Temperatur: die Doppelhelix auseinanderfallen.
- Hybridisierung: Die große, unhandliche Proben-DNA wird bei niedriger Temperatur einen Moment lang in der Lösung mit den schnell beweglichen Primern abgesetzt. hybridisieren. Es bleibt nicht genug Zeit, um die Denaturierung rückgängig zu machen.
- Verlängerung: es Polymerase beginnt mit den gebundenen Primern bei mittlerer Temperatur, um die einzelsträngige DNA zu doppelsträngiger DNA zu ergänzen.
Nach dem dritten Schritt enthält die Lösung doppelt so viel der gewünschten DNA wie zuvor. Durch mehrmaliges Wiederholen der Schritte (z. B. 30) erhält man a exponentielles Wachstum die gewünschte DNA-Menge.
Da die Polymerase nur in Richtung der Zielsequenz kopiert, ist dieses Stück exponentiell kopiert, während andere DNA bereits im dritten Zyklus nicht mehr kopiert wird. Als Ergebnis gibt es nach dreißig Zyklen Milliarden von Kopien der Zielsequenz und immer noch nur ein winziges Stück anderer DNA.
Es DNA-Polymerase von (der Bakterien) Thermus aquaticus oder von Pyrococcus furiosus, die in . enthalten heiße Quellen und Geysire Leben, wird zum Wohle des Thermostabilität. Während der verschiedenen Zyklen einer PCR-Reaktion Temperaturen die Polymerasen von nicht-thermophilen Organismen denaturieren.
Grundierungen
EIN Grundierung ist ein kleines Stück einzelsträngiger RNA oder DNA, das als Ausgangspunkt der PCR verwendet wird. Es werden immer zwei Primer benötigt, einer für den 5'-Strang und einer für den 3'-Strang. Der beste Primer für die PCR ist relativ kurz RNA-streng. Dieser Strang wird künstlich mit einem Gemaakt . hergestellt RNA-Polymerase. Der RNA-Strang wird dann durch DNA-Polymerase in eine kurze einzelsträngige DNA umgewandelt. Dieser DNA-Strang ist so kurz, dass er sich automatisch an ein weiteres komplementäres Stück einzelsträngiger DNA anlagert und so den Ausgangspunkt für die Reproduzieren. Ein guter Primer ist nicht zu kurz, denn das beeinflusst die Spezifität. Ein zu langer Primer hat theoretisch eine höhere Spezifität, könnte aber Sekundärstrukturen bilden, wodurch die PCR kaum oder gar nicht effektiv ist.
Vom Primer wird die DNA in 3'-Richtung kopiert. DNA wird immer von 5' bis 3' aufgebaut.
Schaltplan
- Durch Erhitzen der DNA auf 90 bis 96 °C werden die beiden Stränge getrennt (Denaturierung) und es entstehen zwei Stränge. stirbt.
- Anschließend haften die Primer aufgrund der langsam sinkenden Temperatur bei einer Temperatur zwischen 45 und 65 °C an den beiden DNA-Einzelsträngen.
- Bei 72 °C verlängert DNA-Polymerase den Primer in 5'-Richtung, wodurch zwei Abschnitte von DNA-Doppelsträngen erzeugt werden.
- Nun werden diese Stücke durch Erhitzen wieder in einzelsträngige DNA gespalten usw. Da die vorhandenen Primer eine bevorzugte Paarung mit den beiden einzelsträngigen DNA aufweisen, die eine Verlängerung dieser Primer darstellen, werden nur diese DNA-Stücke repliziert. Nach einigen Zyklen ist so viel DNA hergestellt, dass sie mit nachgewiesen werden kann Gelelektrophorese.
Praktisch
Eine Mischung aus DNA-Probe, DNA-Polymerase, zwei spezifischen Primern (5' und 3'), dNTPs (ein Oberbegriff für die vier DesoxyriboNukleotide: dATP, dCTP, dGTP und dTTP ebenfalls Oligonukleotide genannt), ein Puffer und Magnesiumchlorid.Es wird eine thermostabile Polymerase verwendetEnzym, wie Taq-Polymerase, das eine optimale Temperatur von etwa 72 °C hat. Der Puffer sorgt für eine optimale pH und Salzkonzentration. Magnesiumchlorid ist der Cofaktor für die Bindung zwischen DNA-Polymerase, DNA und NTP, der die Prozessgeschwindigkeit gegen die Genauigkeit ausbalanciert.
Der Rest des Prozesses ist eine Frage der Temperaturänderungen zum richtigen Zeitpunkt. Als Beispiel das Vorgehen für humane DNA mit Taq-Polymerase:
- Die Denaturierungsphase wird bei 94 °C durchgeführt, in der die beiden DNA-Stränge getrennt werden
- Die Hybridisierung bei 45-65°C, Annealing der Oligonukleotide und Primer
- Zur Kettenverlängerung (Elongation) wird die Temperatur wieder auf 72 °C erhöht, wobei die Oligonukleotide als Primer für die taq-Polymerase dienen
Danach wird der Vorgang 30-40 Mal wiederholt.
Echtzeit-PCR
Mit der Real-Time-PCR-Methode, auch quantitative oder kinetische PCR-Methode (qPCR) genannt, kann die DNA bereits während der PCR nachgewiesen werden; Dies ist eine schnelle Methode zum Erkennen Mikroorganismen. Real-time PCR ermöglicht sowohl den Nachweis (Erkennung) als Quantifizierung einer oder mehrerer spezifischer Nukleinsäuresequenzen (Sequenzen) in der DNA-Probe.
Markierte Sonden binden an einen bestimmten DNA-Abschnitt und sind nicht nachweisbar, wenn die Sonde intakt ist. Sobald die Polymerase-Kettenreaktion beginnt, wird die Sonde abgebaut und die Markierung wird sichtbar. Fluoreszierend Tags gehen Licht von einem bestimmten Wellenlänge übertragen. Je mehr DNA umgewandelt wird, desto stärker ist das Signal. Dieses Signal, ausgedrückt in RFUs (Relative Fluorescent Unit), wird grafisch gegen den Schwellenzyklus aufgetragen (Schwellwert, bezeichnet durch Ct-Wert), der Zyklus im PCR-Prozess, bei dem die Erregung des vom Etikett abgegebenen Lichts überschreitet die Nachweisgrenze. Da qPCRs auch Standards beinhalten, bei denen die DNA-Menge bekannt ist, a Kalibrierlinie geplottet werden. Von diesem linearen Diagramm die DNA-Menge wird berechnet, indem der Schwellenzyklus gegen die Erregung aufgetragen wird.
PCR-ELISA
Die PCRELISAtest ist eine kostengünstigere Alternative zur Real-Time-PCR-Methode.
Geschichte und Nutzung
Die Reaktion wurde 1983 von Kary Mullis und wird unter anderem verwendet, um kleine Zahlen zu demonstrieren und zu analysieren Bakterien und Viren und beim Aufarbeiten von Spuren Sperma oder andere Körperzellen (Haarwurzeln, Blutkörperchen), die Täter bei Straftaten beim Opfer hinterlassen haben.
Kontaminationen von Nutzpflanzen mit GVO-Pollen können seit 2005 mit einer Sensitivität von 1 zu 20.000 oder 0,005% nachgewiesen werden. Um das Jahr 2000 lag die Nachweisgrenze noch bei 1,0-0,1 %.
Externe Links
Quellen, Anmerkungen und/oder Verweise
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