WikiDer > Анализ близости лигирования

Proximity ligation assay
Рисунок 1: PLA начинается со связывания антител из разных видов до 2 интересующих белков, в данном случае белок * (звезда) и белок #

Анализ близости лигирования (на месте PLA) это технологии что расширяет возможности традиционных иммуноанализы включить прямое обнаружение белки, белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации с высокой специфичностью и чувствительностью.[1] Белковые мишени могут быть легко обнаружены и локализованы с разрешением отдельных молекул и объективно количественно определены в немодифицированных клетках и тканях. Используя только несколько клеток, субклеточные события, даже временные или слабые взаимодействия, выявляются in situ, и субпопуляции клеток могут быть дифференцированы. Через несколько часов результаты обычного коиммунопреципитация и методы совместной локализации могут быть подтверждены.[2]

Принцип PLA

фигура 2: Связывание зондов PLA.

Два основных антитела выращенные у разных видов распознают цель антиген на интересующие белки (рис. 1). Вторичные антитела (2о Ab) направлен против постоянные регионы различных первичных антител, называемых зондами PLA, связываются с первичными антителами (рис. 2).

Рисунок 3: По кругу запускается синтез ДНК.

Каждый из зондов PLA имеет короткую последовательность, специфичную для Цепь ДНК прикреплен к нему. Если зонды PLA находятся в непосредственной близости (то есть, если два исходных интересующих белка находятся поблизости или являются частью белкового комплекса, как показано на рисунках), нити ДНК могут участвовать в катящийся круг Синтез ДНК при добавлении двух других последовательностей ДНК-олигонуклеотидов вместе с соответствующими субстратами и ферментами (рис. 3).

Рисунок 4: Флуоресцентные зонды связываются с амплифицированной ДНК.

В результате реакции синтеза ДНК происходит многократное усиление круга ДНК. Затем добавляются комплементарные олигонуклеотидные зонды с флуоресцентной меткой, и они связываются с амплифицированной ДНК (рис. 4). В результате высокая концентрация флуоресценция хорошо виден как отчетливое яркое пятно при просмотре с флуоресцентный микроскоп.[3] В показанном конкретном случае (Рисунок 5) ядро увеличен, потому что это B-клетка лимфома клетка. Два интересующих белка - это Рецептор В-клеток и MYD88. Обнаружение взаимодействия в цитоплазме было интересным, поскольку считается, что рецепторы В-клеток расположены в клеточной мембране.[4]

Рисунок 5: Изображение флуоресцентной микроскопии, показывающее взаимодействие белков в цитоплазме. Ядро выделено синим, продукт PLA - красным.

Приложения

PLA, как описано выше, использовался для изучения аспектов развитие животных[5][6] и рак молочной железы[7][8] среди многих других тем. Вариант метода (rISH-PLA) был использован для изучения ассоциации белка и РНК.[9] Другой вариант in situ PLA включает в себя мультиплексный анализ PLA, который позволяет визуализировать несколько белковых комплексов параллельно.[10]. PLA также можно комбинировать с другими формами считывания, такими как ELISA,[11] проточной цитометрии.[12][13] и Вестерн-блоттинг[14]

Рекомендации

  1. ^ Gullberg M, Gústafsdóttir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S (июнь 2004 г.). «Обнаружение цитокинов с помощью бесконтактного лигирования на основе антител». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 101 (22): 8420–4. Bibcode:2004ПНАС..101.8420Г. Дои:10.1073 / pnas.0400552101. ЧВК 420409. PMID 15155907.
  2. ^ Седерберг О., Гуллберг М., Ярвиус М., Риддерстроле К., Леуховиус К. Дж., Ярвиус Дж., Вестер К., Хайдбринг П., Бахрам Ф., Ларссон Л. Г., Ландегрен Ю. (декабрь 2006 г.). «Прямое наблюдение индивидуальных эндогенных белковых комплексов in situ путем лигирования близости». Природные методы. 3 (12): 995–1000. Дои:10.1038 / nmeth947. PMID 17072308. S2CID 21819907.
  3. ^ Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Fredriksson S, Gullberg M, Söderberg O, Jarvius M, Jarvius J, Howell M, Landegren U (октябрь 2005 г.). «Тесты лигирования близости для чувствительных и специфических анализов белков». Аналитическая биохимия. 345 (1): 2–9. Дои:10.1016 / j.ab.2005.01.018. PMID 15950911.
  4. ^ Стаудт, Луи. «Терапия лимфомы, основанная на функциональной и структурной геномике». videocast.nih.gov. Национальные институты здоровья. Получено 3 февраля 2017.
  5. ^ Ван С., Ю С., Ким Х.Й., Ван М., Чжэн С., Паркхаус В., Кригер С., Харден Н. (январь 2015 г.). «Обнаружение in situ белок-белковых комплексов в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы с использованием метода лигирования близости». Журнал визуализированных экспериментов (95): 52139. Дои:10.3791/52139. ЧВК 4354543. PMID 25650626.
  6. ^ Квон Дж, Чон С.М., Чхве И., Ким Н.Х. (2016). «ADAM10 участвует в сборке клеточных соединений на раннем этапе развития эмбрионов свиней». PLOS ONE. 11 (4): e0152921. Bibcode:2016PLoSO..1152921K. Дои:10.1371 / journal.pone.0152921. ЧВК 4820119. PMID 27043020.
  7. ^ Карамузис М.В., Далагиоргу Г., Георгопулу Ю., Нонни А., Контос М., Папавассилиу А.Г. (февраль 2016 г.). «Нацеливание на HER-3 изменяет характер димеризации членов семейства белков ErbB в карциномах молочной железы». Oncotarget. 7 (5): 5576–97. Дои:10.18632 / oncotarget.6762. ЧВК 4868707. PMID 26716646.
  8. ^ Винсент А., Бертель Е., Даше Е., Магнард С., Венеция, Нидерланды (апрель 2016 г.). «BRCA1 влияет на передачу сигналов протеинфосфатазы 6 посредством взаимодействия с ANKRD28». Биохимический журнал. 473 (7): 949–60. Дои:10.1042 / BJ20150797. PMID 27026398.
  9. ^ Roussis IM, Guille M, Myers FA, Scarlett GP (2016). «Анализ близости лигирования гибридизации in situ с целиком РНК (rISH-PLA), анализ для обнаружения комплексов РНК-белок в интактных клетках». PLOS ONE. 11 (1): e0147967. Bibcode:2016PLoSO..1147967R. Дои:10.1371 / journal.pone.0147967. ЧВК 4732756. PMID 26824753.
  10. ^ Leuchowius KJ, Clausson CM, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A, et al. (Июнь 2013). «Параллельная визуализация множественных белковых комплексов в отдельных клетках опухолевой ткани». Молекулярная и клеточная протеомика. 12 (6): 1563–71. Дои:10.1074 / mcp.O112.023374. ЧВК 3675814. PMID 23436906.
  11. ^ Эбай Т., Соуза де Оливейра FM, Лёф Л., Вик Л., Швайгер С., Ларссон А. и др. (Сентябрь 2017 г.). «Аналитически чувствительное обнаружение белка в микротитровальных планшетах с помощью лигирования по близости с амплификацией по кругу». Клиническая химия. 63 (9): 1497–1505. Дои:10.1373 / Clinchem.2017.271833. PMID 28667186.
  12. ^ Leuchowius KJ, Weibrecht I, Landegren U, Gedda L, Söderberg O (октябрь 2009 г.). «Проточный цитометрический анализ лигирования близости in situ взаимодействий белков и посттрансляционной модификации семейства рецепторов эпидермального фактора роста». Цитометрия. Часть А. 75 (10): 833–9. Дои:10.1002 / cyto.a.20771. PMID 19650109. S2CID 2550136.
  13. ^ Лёф Л., Арнгорден Л., Олссон-Стрёмберг У., Сиарт Б., Янссон М., Далин Дж. С. и др. (Апрель 2017 г.). «Проточно-цитометрическое измерение клеток крови с использованием слитого белка BCR-ABL1 при хроническом миелоидном лейкозе». Научные отчеты. 7 (1): 623. Bibcode:2017НатСР ... 7..623Л. Дои:10.1038 / s41598-017-00755-у. ЧВК 5429594. PMID 28377570.
  14. ^ Лю Ю., Гу Дж., Хагнер-МакВиртер Å, Сатиянараянан П., Гуллберг М., Седерберг О. и др. (Ноябрь 2011 г.). «Вестерн-блоттинг с помощью бесконтактного лигирования для высокоэффективного анализа белков». Молекулярная и клеточная протеомика. 10 (11): O111.011031. Дои:10.1074 / mcp.O111.011031. ЧВК 3226413. PMID 21813417.