WikiDer > Секвенирование по Сэнгеру - Википедия

Sanger sequencing - Wikipedia

Секвенирование по Сэнгеру это метод Секвенирование ДНК основанный на избирательном включении обрывающих цепь дидезоксинуклеотиды к ДНК-полимераза в течение in vitro Репликация ДНК.[1][2] После первой разработки Фредерик Сэнгер и его коллегами в 1977 году, он стал наиболее широко используемым методом секвенирования примерно за 40 лет. Впервые он был коммерциализирован Прикладные биосистемы в 1986 г.[3] Совсем недавно секвенирование по Сэнгеру с большим объемом было заменено на "Следующее поколение" методы секвенирования, особенно для крупномасштабных автоматизированных геном анализы. Однако метод Сэнгера по-прежнему широко используется для небольших проектов и для проверки результатов Next-Gen. Он по-прежнему имеет преимущество перед технологиями секвенирования с коротким считыванием (такими как Illumina) в том, что он может производить считывания последовательности ДНК более 500. нуклеотиды.

Метод Сэнгера (обрыва цепи) для секвенирования ДНК.

Метод

Флуоресцентные молекулы ddNTP

Классический метод обрыва цепи требует одноцепочечной ДНК-матрицы, ДНК. грунтовка, а ДНК-полимераза, нормальные дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ) и модифицированные дидезоксинуклеотидтрифосфаты (ддНТФ), последние из которых останавливают удлинение цепи ДНК. Эти обрывающие цепь нуклеотиды лишены 3'-ОЙ группа, необходимая для формирования фосфодиэфирная связь между двумя нуклеотидами, заставляя ДНК-полимеразу прекращать удлинение ДНК при включении модифицированного ddNTP. DdNTP могут быть радиоактивными или флуоресцентно помечены для обнаружения в автоматических секвенаторах.

Образец ДНК делится на четыре отдельные реакции секвенирования, содержащие все четыре стандартных дезоксинуклеотиды (dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и ДНК-полимераза. К каждой реакции добавляется только один из четырех дидезоксинуклеотиды (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP), тогда как другие добавленные нуклеотиды являются обычными. Концентрация дезоксинуклеотида должна быть примерно в 100 раз выше, чем концентрация соответствующего дидезоксинуклеотида (например, 0,5 мМ dTTP: 0,005 мМ ddTTP), чтобы обеспечить образование достаточного количества фрагментов при сохранении транскрипции полной последовательности (но концентрация ddNTP также зависит от желаемого длина последовательности).[2] Выражаясь в более разумном порядке, в этом процессе необходимы четыре отдельных реакции для тестирования всех четырех ddNTP. После раундов удлинения матричной ДНК из связанного праймера полученные фрагменты ДНК нагревают. денатурированный и разделены по размеру с помощью гель-электрофорез. В оригинальной публикации 1977 г.[2] образование спаренных оснований петель оцДНК было причиной серьезных трудностей в разрешении полос в некоторых местах. Это часто выполняется с использованием денатурирующего полиакриламид-мочевина с каждой из четырех реакций, проходящих по одной из четырех отдельных дорожек (дорожки A, T, G, C). Затем полосы ДНК можно визуализировать с помощью авторадиография или УФ-свет, и последовательность ДНК может быть непосредственно считана с Рентгеновская пленка или гелевое изображение.

Часть геля для секвенирования с радиоактивной меткой

На изображении справа рентгеновская пленка подвергалась воздействию геля, а темные полосы соответствуют фрагментам ДНК разной длины. Темная полоса на дорожке указывает на фрагмент ДНК, который является результатом обрыва цепи после включения дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP). Затем относительные положения различных полос на четырех полосах снизу вверх используются для считывания последовательности ДНК.

Фрагменты ДНК метят радиоактивной или флуоресцентной меткой на праймере (1), в новой цепи ДНК - меченым dNTP или меченным ddNTP.

Технические варианты секвенирования с окончанием цепи включают мечение нуклеотидами, содержащими радиоактивный фосфор для радиоактивная маркировка, или используя праймер, помеченный на 5 'конце флуоресцентный краситель. Секвенирование красителей и праймеров облегчает считывание в оптической системе для более быстрого и экономичного анализа и автоматизации. Позднее развитие Лерой Худ и коллеги[4][5] флуоресцентно меченых ddNTP и праймеров закладывают основу для автоматизированного высокопроизводительного секвенирования ДНК.

Последовательная лестница путем радиоактивного секвенирования по сравнению с флуоресцентными пиками

Методы обрыва цепи значительно упростили секвенирование ДНК. Например, коммерчески доступны наборы на основе обрыва цепи, которые содержат реагенты, необходимые для секвенирования, предварительно аликвотированные и готовые к использованию. Ограничения включают неспецифическое связывание праймера с ДНК, влияющее на точное считывание последовательности ДНК, и вторичные структуры ДНК, влияющие на точность последовательности.

Секвенирование красителя-терминатора

Капиллярный электрофорез

Секвенирование красителя-терминатора использует метку терминатора цепи ddNTP, что позволяет секвенировать в одной реакции, а не в четырех реакциях, как в методе меченых праймеров. При секвенировании красителя-терминатора каждый из четырех терминаторов дидезоксинуклеотидной цепи метят флуоресцентными красителями, каждый из которых излучает свет с разными длины волн.

Из-за большей целесообразности и скорости секвенирование терминатора красителя в настоящее время является основой автоматизированного секвенирования. Его ограничения включают эффекты красителя из-за различий во включении меченных красителем терминаторов цепи во фрагмент ДНК, что приводит к неодинаковым высотам и формам пиков на электронном следе последовательности ДНК. хроматограмма после капиллярный электрофорез (см. рисунок слева).

Эта проблема была решена с использованием модифицированных ферментных систем ДНК-полимеразы и красителей, которые минимизируют вариабельность включения, а также способов устранения «пятен красителя». Метод секвенирования с использованием красителя-терминатора, наряду с автоматизированными высокопроизводительными анализаторами последовательности ДНК, использовался в подавляющем большинстве проектов секвенирования до появления технологии секвенирования нового поколения.

Автоматизация и подготовка проб

Вид начала примера чтения терминатора красителя

Инструменты для автоматического секвенирования ДНК (Секвенаторы ДНК) может секвенировать до 384 образцов ДНК в одной партии. Пакетные прогоны могут выполняться до 24 раз в день. Секвенсоры ДНК разделяют нити по размеру (или длине), используя капиллярный электрофорез, они обнаруживают и записывают флуоресценцию красителя и выводят данные в виде графика флуоресцентного пика. хроматограммы. Секвенирование реакций (термоциклирование и маркировка), очистка и повторное суспендирование образцов в буферный раствор выполняются отдельно перед загрузкой образцов в секвенатор. Ряд коммерческих и некоммерческих программных пакетов могут автоматически обрезать некачественные следы ДНК. Эти программы оценивают качество каждого пика и удаляют базовые пики низкого качества (которые обычно расположены на концах последовательности). По точности такие алгоритмы уступают визуальному осмотру человеком-оператором, но подходят для автоматизированной обработки больших наборов данных последовательности.

Вызовы

Общие проблемы секвенирования ДНК с помощью метода Сэнгера включают низкое качество первых 15-40 оснований последовательности из-за связывания праймера.[нужна цитата] и ухудшение качества следов секвенирования после 700-900 оснований. Программное обеспечение для базовых вызовов, такое как Фред обычно обеспечивает оценку качества, чтобы помочь в обрезке низкокачественных участков последовательностей.[6][7]

В случаях, когда фрагменты ДНК клонированный перед секвенированием результирующая последовательность может содержать части клонирование вектор. В отличие, ПЦРтехнологии клонирования и секвенирования нового поколения на основе пиросеквенирование часто избегают использования векторов клонирования. Недавно были разработаны методы одноэтапного секвенирования по Сэнгеру (комбинированная амплификация и секвенирование), такие как Ampliseq и SeqSharp, которые позволяют быстро секвенировать целевые гены без клонирования или предварительной амплификации.[8][9]

Текущие методы могут напрямую упорядочивать только относительно короткие (300-1000 нуклеотиды длинные) фрагменты ДНК за одну реакцию. Основным препятствием для секвенирования фрагментов ДНК, превышающих этот предел размера, является недостаточная способность разделения для разделения больших фрагментов ДНК, которые отличаются по длине только на один нуклеотид.

Микрожидкостное секвенирование по Сэнгеру

Микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру - это лаборатория на кристалле приложение для секвенирования ДНК, в котором этапы секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование, очистка образцов и капиллярный электрофорез) интегрированы в чип в масштабе пластины с использованием объемов образцов в нанолитровом масштабе. Эта технология генерирует длинные и точные считывания последовательностей, устраняя при этом многие существенные недостатки традиционного метода Сэнгера (например, высокий расход дорогостоящих реагентов, использование дорогостоящего оборудования, трудоемкие операции и т. Д.) За счет интеграции и автоматизации этапов секвенирования по Сэнгеру .

В настоящее время высокопроизводительное секвенирование генома включает в себя фрагментацию генома на небольшие одноцепочечные части с последующей амплификацией фрагментов с помощью Полимеразной цепной реакции (ПЦР). Приняв метод Сэнгера, каждый фрагмент ДНК необратимо обрывается за счет включения флуоресцентно меченного дидезокси-цепи нуклеотида, обрывающего цепь, тем самым образуя «лестницу» ДНК из фрагментов, каждый из которых отличается по длине на одно основание и несет специфичную для основания флуоресцентную метку на терминальная база. Затем амплифицированные базовые лестницы разделяются с помощью капиллярного решеточного электрофореза (CAE) с автоматическим на месте Обнаружение «финишной черты» флуоресцентно меченных фрагментов оцДНК, которое обеспечивает упорядоченную последовательность фрагментов. Эти считывания последовательностей затем собираются компьютером в перекрывающиеся или смежные последовательности (называемые «контиги»), которые напоминают полную геномную последовательность после полной сборки.[10]

Методы Сэнгера позволяют получить длину считывания примерно 800 п.н. (обычно 500-600 п.н. с необогащенной ДНК). Большая длина считывания в методах Сэнгера демонстрирует значительные преимущества перед другими методами секвенирования, особенно с точки зрения секвенирования повторяющихся областей генома. Проблема с данными коротко читаемых последовательностей особенно актуальна при секвенировании новых геномов. (de novo) и в секвенировании сильно перестроенных сегментов генома, обычно тех, которые наблюдаются в геномах рака или в областях хромосом, которые демонстрируют структурные вариации.[11]

Применение технологий микрофлюидного секвенирования

Другие полезные применения секвенирования ДНК включают: однонуклеотидный полиморфизм (SNP) обнаружение, однонитевой конформационный полиморфизм (SSCP) гетеродуплексный анализ, и короткий тандемный повтор (STR) анализ. Разрешение фрагментов ДНК в соответствии с различиями в размере и / или конформации является наиболее важным шагом в изучении этих особенностей генома.[10]

Дизайн устройства

Чип секвенирования имеет четырехслойную конструкцию, состоящую из трех стеклянных пластин диаметром 100 мм (на которых микропроизводятся элементы устройства) и полидиметилсилоксановой (PDMS) мембраны. Реакционные камеры и каналы капиллярного электрофореза протравлены между двумя верхними стеклянными пластинами, которые термически связаны. Трехмерные межсоединения каналов и микроклапаны образованы ПДМС и стеклянной пластиной нижнего коллектора.

Устройство состоит из трех функциональных блоков, каждый из которых соответствует этапам секвенирования по Сэнгеру. Блок термоциклирования (TC) представляет собой реакционную камеру объемом 250 нанолитров со встроенным резистивным датчиком температуры, микроклапанами и поверхностным нагревателем. Движение реагента между верхним цельностеклянным слоем и нижним слоем стекло-PDMS происходит через сквозные отверстия диаметром 500 мкм. После термоциклирования реакционная смесь проходит очистку в камере улавливания / очистки, а затем вводится в камеру капиллярного электрофореза (CE). Блок CE состоит из 30-сантиметрового капилляра, который свернут в компактную структуру с помощью витков шириной 65 мкм.

Секвенирование химии

Термоциклирование
В реакционной камере TC реагент для секвенирования красителя-терминатора, матричная ДНК и праймеры загружаются в камеру TC и термоциклированный на 35 циклов (при 95 ° C в течение 12 секунд и при 60 ° C в течение 55 секунд).
Очищение
Заряженную реакционную смесь (содержащую удлинительные фрагменты, матричную ДНК и избыточный реактив для секвенирования) пропускают через камеру улавливания / очистки при 30 ° C с помощью электрического поля 33 В / см, приложенного между выходным портом захвата и входным портом. Гель для захвата, через который проходит образец, состоит из 40 мкМ олигонуклеотида (комплементарного праймерам), ковалентно связанного с полиакриламидной матрицей. Удлинительные фрагменты иммобилизуются гелевой матрицей, а избыток праймера, матрицы, свободных нуклеотидов и солей элюируется через порт захвата для отходов. Улавливающий гель нагревают до 67-75 ° C для высвобождения удлиненных фрагментов.
Капиллярный электрофорез
Фрагменты удлинения вводят в камеру CE, где их подвергают электрофорезу в поле 125–167 В / см.

Платформы

Платформа Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Дублин, Калифорния)[12] объединяет первые два этапа секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование и очистка) в полностью автоматизированную систему. Производитель заявляет, что образцы готовы к капиллярному электрофорезу в течение трех часов после загрузки образца и реагентов в систему. Платформа Apollo 100 требует субмикролитровых объемов реагентов.

Сравнение с другими методами секвенирования

Значения производительности для технологий секвенирования генома, включая методы Сэнгера и методы следующего поколения[11][13][14]
ТехнологииКоличество полосОбъем впрыска (нл)Время анализаСредняя длина чтенияПропускная способность (включая анализ; МБ /час)Заливка геляОтслеживание полосы движения
Плита гель96500–10006–8 часов700 п.н.0.0672дада
Электрофорез капиллярной матрицы961–51–3 часа700 п.н.0.166НетНет
Микрочип960.1–0.56–30 минут430 п.н.0.660НетНет
454 / Roche FLX (2008)< 0.0014 часа200–300 п.н.20–30
Иллюмина / Solexa (2008)2–3 дня30–100 п.н.20
ABI / SOLiD (2008)8 дней35 п.н.5–15
Illumina MiSeq (2019)1–3 дня2x75–2x300 п.н.170–250
Иллюмина NovaSeq (2019)1-2 дня2x50–2x150 п.н.22,000–67,000
Ион Торрент Ион 530 (2019)2,5–4 часа200–600 п.н.110–920
BGI MGISEQ-T7 (2019)1 день2x150 п.н.250,000
SMRT Pacific Biosciences (2019)10–20 часов10–30 кб1,300
Oxford Nanopore MinIon (2019)3 дня13–20 кб[15]700

Конечной целью высокопроизводительного секвенирования является разработка недорогих и чрезвычайно эффективных систем для получения расширенных (более длинных) длин чтения. Увеличение длины чтения каждого отдельного электрофоретического разделения существенно снижает затраты, связанные с секвенированием ДНК de novo, и количество матриц, необходимых для секвенирования контигов ДНК с заданной избыточностью. Микрофлюидика может позволить более быструю, дешевую и легкую сборку последовательности.[10]

Рекомендации

  1. ^ Sanger F; Колсон AR (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол. 94 (3): 441–8. Дои:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841.
  2. ^ а б c Sanger F; Никлен С; Колсон А.Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 74 (12): 5463–7. Bibcode:1977ПНАС ... 74.5463С. Дои:10.1073 / pnas.74.12.5463. ЧВК 431765. PMID 271968.
  3. ^ Адамс, Джилл У. (2008). «Технологии секвенирования ДНК». Природное образование. Получено 24 октября, 2019.
  4. ^ Смит Л. М., Сандерс Дж. З., Кайзер Р. Дж. И др. (1986). «Обнаружение флуоресценции в автоматическом анализе последовательности ДНК». Природа. 321 (6071): 674–9. Bibcode:1986Натура.321..674С. Дои:10.1038 / 321674a0. PMID 3713851. S2CID 27800972. Мы разработали метод частичной автоматизации анализа последовательности ДНК. Детектирование флуоресценции фрагментов ДНК осуществляется с помощью флуорофора, ковалентно присоединенного к олигонуклеотидному праймеру, используемому в ферментативном анализе последовательности ДНК. Для каждой реакции, специфичной для оснований A, C, G и T, используется флуорофор разного цвета. Реакционные смеси объединяются и подвергаются со-электрофорезу в одной пробирке с полиакриламидным гелем, отдельные флуоресцентные полосы ДНК обнаруживаются на дне. трубки, и информация о последовательности получается непосредственно компьютером.
  5. ^ Smith LM; Fung S; Hunkapiller MW; Hunkapiller TJ; Худ ЛЕ (апрель 1985 г.). «Синтез олигонуклеотидов, содержащих алифатическую аминогруппу на 5'-конце: синтез флуоресцентных праймеров ДНК для использования в анализе последовательности ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 13 (7): 2399–412. Дои:10.1093 / nar / 13.7.2399. ЧВК 341163. PMID 4000959.
  6. ^ «Phred - Обзвон качественной базы». Получено 2011-02-24.
  7. ^ Ледергербер, К; Дессимоз, К. (2011). «Базовый вызов для платформ секвенирования следующего поколения». Брифинги по биоинформатике. 12 (5): 489–97. Дои:10.1093 / bib / bbq077. ЧВК 3178052. PMID 21245079.
  8. ^ Мерфи, К .; Berg, K .; Эшлеман, Дж. (2005). «Секвенирование геномной ДНК путем комбинированной реакции амплификации и циклического секвенирования». Клиническая химия. 51 (1): 35–39. Дои:10.1373 / Clinchem.2004.039164. PMID 15514094.
  9. ^ Сенгупта, Д. .; Куксон, Б. (2010). «SeqSharp: общий подход к совершенствованию циклического секвенирования, который обеспечивает надежный одностадийный комбинированный метод амплификации и секвенирования». Журнал молекулярной диагностики. 12 (3): 272–277. Дои:10.2353 / jmoldx.2010.090134. ЧВК 2860461. PMID 20203000.
  10. ^ а б c Кан, Чеук-Вай; Фредлейк, Кристофер П.; Доэрти, Эрин А. С .; Бэррон, Аннелиз Э. (1 ноября 2004 г.). «Секвенирование ДНК и генотипирование в миниатюрных системах электрофореза». Электрофорез. 25 (21–22): 3564–3588. Дои:10.1002 / elps.200406161. PMID 15565709. S2CID 4851728.
  11. ^ а б Морозова, Елена; Марра, Марко А (2008). «Применение технологий секвенирования нового поколения в функциональной геномике». Геномика. 92 (5): 255–64. Дои:10.1016 / j.ygeno.2008.07.001. PMID 18703132.
  12. ^ Microchip Biologies Inc. Аполлон 100
  13. ^ Синвилл, Рондедрик; Сопер, Стивен А. (2007). «Разделение ДНК высокого разрешения с использованием микрочип-электрофореза». Журнал сепарационной науки. 30 (11): 1714–28. Дои:10.1002 / jssc.200700150. PMID 17623451.
  14. ^ Кумар, Кишор; Коули, Марк; Дэвис, Райан (2019). «Секвенирование нового поколения и новые технологии». Семинары по тромбозу и гемостазу. 45 (7): 661–673. Дои:10.1055 / с-0039-1688446. ISSN 0094-6176. PMID 31096307.
  15. ^ Тайсон, Джон Р .; О'Нил, Найджел Дж .; Джайн, митен; Olsen, Hugh E .; Хитер, Филипп; Снатч, Терренс П. (2018). «Последовательное секвенирование и сборка на основе MinION расширяет эталонный геном Caenorhabditis elegans». Геномные исследования. 28 (2): 266–274. Дои:10.1101 / гр.221184.117. ISSN 1088-9051. ЧВК 5793790. PMID 29273626.

дальнейшее чтение

внешняя ссылка