WikiDer > Одноклеточная изменчивость

Single-cell variability

В клеточная биология, одноклеточная изменчивость происходит, когда отдельные клетки в аналогичной популяции отличаются по форме, размеру, положению в клеточный цикл, или характеристики на молекулярном уровне. Такие различия можно обнаружить с помощью современных одноклеточный анализ техники.[1] Исследование изменчивости в популяции клеток способствует пониманию развивающий и патологический процессы,

Пример анализа отдельных клеток. Здесь используется программное обеспечение для визуализации, отслеживающее отдельные клетки по мере их миграции с течением времени.[2]

Одноклеточный анализ

Выборка ячеек может казаться похожей, но ячейки могут различаться по своим индивидуальным характеристикам, таким как форма и размер, экспрессия мРНК уровни геном, или отдельные подсчеты метаболиты. В прошлом единственные доступные методы исследования таких свойств требовали популяции клеток и обеспечивали оценку интересующей характеристики, усредненной по популяции, что могло скрыть важные различия между клетками. Анализ отдельных клеток позволяет ученым с высокой точностью изучать свойства одной интересующей клетки, выявляя индивидуальные различия между популяциями и предлагая новые идеи в молекулярной биологии. Эти индивидуальные различия важны в таких областях, как биология развития, где отдельные клетки могут действовать по-разному.судьбы»- становятся специализированными клетками, такими как нейроны или ткань органа - во время роста эмбриона; в исследования рака, где отдельные злокачественные клетки могут различаться по своей реакции на терапию; или в инфекционное заболевание, где только часть клеток в популяции заражается возбудитель.

Представления ячеек на уровне популяции могут предложить искаженное представление данных за счет усреднения свойств отдельных подмножеств ячеек.[3] Например, если половина клеток определенной группы экспрессируют высокие уровни данного гена, а остальные - низкие уровни, результаты популяционного анализа могут выглядеть так, как будто все клетки экспрессируют средний уровень данного гена. . Таким образом, одноклеточный анализ позволяет исследователям более детально изучать биологические процессы и отвечать на вопросы, которые нельзя было бы решить иначе.

Виды вариации

Вариация экспрессии генов

Клетки с идентичными геномами могут различаться по выражение генов из-за различий в их специализированных функциях в организме, их момент времени в клеточный цикл, их окружение, а также шум и стохастический факторы. Таким образом, точное измерение экспрессии генов в отдельных клетках позволяет исследователям лучше понять эти важные аспекты клеточной биологии. Например, раннее изучение экспрессии генов в отдельных клетках в плодовая муха Эмбрионы позволили ученым обнаружить регуляризованные паттерны или градиенты транскрипции определенных генов на разных стадиях роста, что позволило более детально понять развитие на уровне места и времени. Другое явление в экспрессии генов, которое может быть идентифицировано только на уровне отдельной клетки, - это колебательная экспрессия генов, при которой ген периодически включается и выключается.

Экспрессию одноклеточного гена обычно анализируют с использованием РНК-последовательность. После выделения клетки протокол RNA-seq обычно состоит из трех этапов:[4] РНК обратная расшифровка в кДНКкДНК амплифицируется, чтобы сделать больше материала доступным для секвенатора, а кДНК последовательный.

Вариация в последовательности ДНК

Популяции одноклеточных организмов, таких как бактерии, обычно немного различаются по своему Последовательность ДНК из-за мутации приобретены при размножении. В пределах одного человека отдельные клетки обычно имеют идентичные геномы, хотя есть интересные исключения, такие как В-клетки, у которых есть вариации в их ДНК, что позволяет им генерировать различные антитела связываться с различными болезнетворными микроорганизмами, которые могут атаковать организм. Измерение различий и скорости изменения содержания ДНК на уровне одной клетки может помочь ученым лучше понять, как патогены развивают устойчивость к антибиотикам, почему иммунная система часто не может производить антитела для быстро мутирующих вирусов, таких как ВИЧ, и другие важные явления.

Существует множество технологий для секвенирования геномов, но они предназначены для использования ДНК из популяции клеток, а не из одной клетки. Основная задача при секвенировании одноклеточного генома состоит в том, чтобы сделать несколько копий (амплифицировать) ДНК, чтобы было достаточно материала для секвенатора, процесс, называемый амплификацией всего генома (WGA). Типичные методы WGA состоят из:[5] (1) Многократное усиление смещения (MDA), в котором многократное грунтовки отжиг ДНК, полимеразы копировать ДНК и отбрасывать другие полимеразы, освобождая цепи, которые могут быть обработаны секвенатором, (2) ПЦРоснованные на методах, или (3) некоторая комбинация обоих.

Вариация в метаболомный характеристики

Клетки различаются по метаболиты они содержат промежуточные соединения и конечные продукты сложных биохимических реакций, поддерживающих клетку. Генетически идентичные клетки в разных условиях и средах могут использовать разные метаболические пути для поддержания себя. Измеряя присутствующие метаболиты, ученые могут сделать вывод об используемых метаболических путях и получить полезную информацию о состоянии клетки. Пример этого можно найти в иммунной системе, где CD4 + клетки могут дифференцироваться в клетки Th17 или TReg (среди других возможностей), которые по-разному направляют ответ иммунной системы. Клетки Th17 стимулируют сильный воспалительный ответ, тогда как клетки TReg стимулируют противоположный эффект. Первые, как правило, больше полагаются на гликолиз,[6] из-за их повышенной потребности в энергии.

Чтобы профилировать метаболический состав клетки, исследователи должны идентифицировать интересующую клетку в большей популяции, изолировать ее для анализа, быстро подавлять ферменты и останавливать метаболические процессы в клетке, а затем использовать такие методы, как ЯМР, масс-спектрометрия, микрофлюидика, и другие методы для анализа содержимого ячейки.[7]

Вариация в протеом

Подобно вариациям в метаболоме, белки присутствуют в клетке, и их количество может варьироваться от клетки к клетке в аналогичной популяции. Пока транскрипция и перевод Чтобы определить количество и разнообразие продуцируемых белков, эти процессы неточны, а клетки обладают рядом механизмов, которые могут изменять или разрушать белки, что делает возможной вариацию в протеоме, которая не может быть объяснена вариацией в экспрессии генов. Кроме того, белки имеют много других важных свойств помимо простого присутствия или отсутствия, например, подверглись ли они посттрансляционные модификации Такие как фосфорилирование, или связаны с интересующими молекулами. Различия в количестве и характеристиках белков имеют значение для таких областей, как исследования рака и терапия рака, где лекарство, нацеленное на конкретный белок, может различаться по своему воздействию из-за вариабельности протеома,[8] или различаются по эффективности из-за более широкого биологического феномена неоднородность опухоли.

Цитометрия, поверхностные методы и микрофлюидические технологии - это три класса инструментов, обычно используемых для профилирования протеомов отдельных клеток.[9] Цитометрия позволяет исследователям изолировать представляющие интерес клетки и окрашивать 15–30 белков для измерения их местоположения и / или относительной численности.[9] Для измерения численности и распределения множественных мишеней в образцах биопсии и тканях были разработаны методы циклического воспроизведения изображений. В этих методах 3-4 мишени окрашиваются флуоресцентно меченными антителами, изображенный, а затем лишили их флуорофоров различными способами, в том числе химическими методами на основе окисления[10] или совсем недавно методы конъюгации антитело-ДНК,[11] возможность окрашивания дополнительных мишеней в последующих циклах; в некоторых методах было визуализировано до 60 отдельных целей.[12] Для поверхностных методов исследователи помещают одну клетку на поверхность, покрытую антителами, которые затем связываются с белками, секретируемыми клеткой, и позволяют их измерять.[9] Методы микрофлюидики для анализа протеома иммобилизуют отдельные клетки на микрочипе и используют окрашивание для измерения представляющих интерес белков или антител для связывания с интересующими белками.

Различия в размере и морфологии клеток

Клетки в схожей популяции могут различаться по размеру и морфологии из-за различий в функциях, изменений в метаболизме или просто нахождения в разных фазах клеточного цикла или какого-либо другого фактора. Например, стволовые клетки может делиться асимметрично,[13] Это означает, что две образовавшиеся дочерние клетки могут иметь разные судьбы (специализированные функции) и могут отличаться друг от друга по размеру или форме. Исследователи, изучающие развитие, могут быть заинтересованы в отслеживании физических характеристик индивидуального потомства в растущей популяции, чтобы понять, как стволовые клетки со временем дифференцируются в сложную ткань или организм.

Микроскопию можно использовать для анализа размера и морфологии клеток путем получения высококачественных изображений с течением времени. Эти изображения обычно содержат популяцию клеток, но алгоритмы может применяться для идентификации и отслеживания отдельных ячеек на нескольких изображениях. Алгоритмы должны уметь обрабатывать гигабайты данных для удаления шума и обобщения соответствующих характеристик для данного вопроса исследования.[14]

Вариация клеточного цикла

Отдельные клетки в популяции часто находятся в разных точках клеточного цикла. Ученым, желающим понять характеристики клетки в определенный момент цикла, будет сложно использовать оценки на уровне популяции, поскольку они будут усреднять измерения клеток на разных этапах. Кроме того, также важно понимание клеточного цикла в отдельных пораженных клетках, например в опухолевых, поскольку они часто имеют совсем другой цикл, чем здоровые клетки. Одноклеточный анализ характеристик клеточного цикла позволяет ученым более подробно разобраться в этих свойствах.

Вариабельность клеточного цикла можно изучить с помощью нескольких из ранее описанных методов. Например, клетки в G2 будут довольно большими по размеру (поскольку они находятся как раз в точке, где они собираются разделиться на две части), и их можно будет идентифицировать с помощью протоколов по размеру и форме ячейки. Ячейки в S фаза копируют их геномы и могут быть идентифицированы с использованием протоколов окрашивания ДНК и измерения ее содержания с помощью проточной цитометрии или количественной флуоресцентной микроскопии, или с помощью зондов для генов, экспрессирующихся с высокой степенью экспрессии в определенных фазах клеточного цикла.

Рекомендации

  1. ^ Хабиби, Иман; Чеонг, Раймонд; Липняцки, Томаш; Левченко, Андре; Emamian, Effat S .; Абди, Али (2017-04-05). «Вычисление и измерение ошибок принятия решений по ячейкам с использованием данных по одной ячейке». PLOS вычислительная биология. 13 (4): e1005436. Дои:10.1371 / journal.pcbi.1005436. ISSN 1553-7358. ЧВК 5397092. PMID 28379950.
  2. ^ Giedt, Рэнди Дж .; Кох, Питер Д .; Вайследер, Ральф; Муньос-Баррутия, Аррате (10 апреля 2013 г.). «Одноклеточный анализ распределения лекарств с помощью прижизненной визуализации». PLoS ONE. 8 (4): e60988. Дои:10.1371 / journal.pone.0060988. ЧВК 3622689. PMID 23593370.
  3. ^ Сандберг, Рикард (30 декабря 2013 г.). «Начало эры одноклеточной транскриптомики в биологии и медицине». Природные методы. 11 (1): 22–24. Дои:10.1038 / nmeth.2764. PMID 24524133.
  4. ^ Saliba, A.-E .; Westermann, A.J .; Горски, С. А .; Фогель, Дж. (22 июля 2014 г.). «Single-cell RNA-seq: достижения и будущие проблемы». Исследования нуклеиновых кислот. 42 (14): 8845–8860. Дои:10.1093 / нар / gku555. ЧВК 4132710. PMID 25053837.
  5. ^ Macaulay, Iain C .; Воет, Тьерри; Майзелс, Нэнси (30 января 2014 г.). «Геномика одиночных клеток: достижения и перспективы на будущее». PLoS Genetics. 10 (1): e1004126. Дои:10.1371 / journal.pgen.1004126. ЧВК 3907301. PMID 24497842.
  6. ^ Барби, Джозеф; Пардолл, Дрю; Пан, Вентилятор (март 2013). «Метаболический контроль оси Treg / Th17». Иммунологические обзоры. 252 (1): 52–77. Дои:10.1111 / imr.12029. ЧВК 3576873. PMID 23405895.
  7. ^ Рубахин, Станислав С; Романова Елена В; Немес, Питер; Свидлер, Джонатан V (30 марта 2011 г.). «Профилирование метаболитов и пептидов в отдельных клетках». Природные методы. 8 (4с): S20 – S29. Дои:10.1038 / nmeth.1549. ЧВК 3312877. PMID 21451513.
  8. ^ Коэн, А. А .; Гева-Заторский, Н .; Eden, E .; Frenkel-Morgenstern, M .; Исаева, И .; Сигал, А .; Milo, R .; Cohen-Saidon, C .; Liron, Y .; Kam, Z .; Cohen, L .; Данон, Т .; Перзов, Н .; Алон, У. (5 декабря 2008 г.). «Динамическая протеомика индивидуальных раковых клеток в ответ на лекарство». Наука. 322 (5907): 1511–1516. Дои:10.1126 / наука.1160165. PMID 19023046.
  9. ^ а б c Вэй, Вэй; Шин, Янг; Ма, Чао; Ван, Цзюнь; Elitas, Meltem; Фан, Ронг; Хит, Джеймс Р. (2013). «Микрочиповые платформы для мультиплексной одноклеточной функциональной протеомики с приложениями в иммунологии и исследованиях рака». Геномная медицина. 5 (8): 75. Дои:10,1186 / gm479. ЧВК 3978720. PMID 23998271.
  10. ^ Соргер, Питер К .; Фаллахи-Сичани, Мохаммад; Лин, Цзя-Рен (24 сентября 2015 г.). «Высоко мультиплексная визуализация отдельных клеток с использованием высокопроизводительного метода циклической иммунофлуоресценции». Nature Communications. 6: 8390. Дои:10.1038 / ncomms9390. ISSN 2041-1723. ЧВК 4587398. PMID 26399630.
  11. ^ Вайследер, Ральф; Юрич, Деян; Кастильо, Андрес Фернандес дель; МакФарланд, Филип Дж .; Карлсон, Джонатан С. Т .; Патания, Дивья; Гедт, Рэнди Дж. (31.10.2018). «Анализ одноклеточного штрих-кода обеспечивает быстрое считывание клеточных сигнальных путей в клинических образцах». Nature Communications. 9 (1): 4550. Дои:10.1038 / s41467-018-07002-6. ISSN 2041-1723. ЧВК 6208406. PMID 30382095.
  12. ^ Линь, Цзя-Рен; Изар, Вениамин; Ван, Шу; Япп, Кларенс; Мэй, Шаолинь; Шах, Парин М; Сантагата, Сандро; Соргер, Питер К. (2018-07-11). Чакраборти, Аруп К; Радж, Арджун; Марр, Карстен; Хорват, Петер (ред.). «Высоко мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация тканей и опухолей человека с использованием t-CyCIF и обычных оптических микроскопов». eLife. 7: e31657. Дои:10.7554 / eLife.31657. ISSN 2050-084X. ЧВК 6075866. PMID 29993362.
  13. ^ Кноблич, Юрген А. (февраль 2008 г.). «Механизмы асимметричного деления стволовых клеток». Клетка. 132 (4): 583–597. Дои:10.1016 / j.cell.2008.02.007. PMID 18295577.
  14. ^ Коэн, А. Р. (3 ноября 2014 г.). «Извлечение смысла из данных биологической визуализации». Молекулярная биология клетки. 25 (22): 3470–3473. Дои:10.1091 / mbc.E14-04-0946. ЧВК 4230605. PMID 25368423.