WikiDer > Саузерн-блот

Southern blot
Гель агарозы
Лоток со стопкой, состоящей сверху вниз из веса, бумажных полотенец, мембрана из нитроцеллюлоза или же нейлон, гель, раствор соли и кусок стекла.
Мембрана саузерн-блоттинга после гибридизация и полоскание.
Саузерн-блот агарозный гель под ультрафиолетовый освещение.
Саузерн-блот авторадиограмма.

А Саузерн-блот это метод, используемый в молекулярная биология для обнаружения специфического Последовательность ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг сочетает перенос электрофорез-разделенные фрагменты ДНК на фильтрующую мембрану и последующее обнаружение фрагментов с помощью гибридизация зонда.

Метод назван в честь Британский биолог Эдвин Саузерн, который впервые опубликовал его в 1975 году.[1] Другой промокание методы (т.е. вестерн-блот,[2] северное пятно, восточная клякса, юго-западное пятно), которые используют аналогичные принципы, но используют РНК или белок, позже были названы со ссылкой на имя Эдвина Саузерна. Поскольку этикетка одноименный, Southern пишется с заглавной буквы, как это принято в имена собственные. Названия других методов блоттинга могут соответствовать этому соглашению по аналогии.[3]

Метод

  1. Ограничение эндонуклеазы используются для разрезания высокомолекулярных цепей ДНК на более мелкие фрагменты.
  2. Затем фрагменты ДНК электрофорез на агарозный гель разделить их по размеру.
  3. Если некоторые из фрагментов ДНК больше 15 kb, затем перед блоттингом гель можно обработать кислотой, например разбавленной HCl. Этот депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля на мембрану.
  4. Если используются щелочные методы переноса, гель ДНК помещают в щелочной раствор (обычно содержащий едкий натр) денатурировать двухцепочечную ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных остатков тимина ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя их на отдельные цепи ДНК для последующего использования. гибридизация к зонду (см. ниже) и разрушает любую остаточную РНК, которая может все еще присутствовать в ДНК. Однако выбор щелочного метода переноса вместо нейтрального часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам.[нужна цитата]
  5. Лист нитроцеллюлоза (или, альтернативно, нейлон) мембрана помещается поверх (или ниже, в зависимости от направления переноса) геля. Давление прилагается к гелю равномерно (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При передаче всасыванием 20X SSC буфер используется для обеспечения герметичности и предотвращения высыхания геля. Передача буфера капиллярное действие из области высоких водный потенциал в область с низким водным потенциалом (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) затем используется для перемещения ДНК из геля на мембрану; ионный обмен взаимодействия связывают ДНК с мембраной из-за отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны.
  6. Затем мембрану запекают в вакууме или обычной печи при 80 ° C в течение 2 часов (стандартные условия; нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или подвергают воздействию ультрафиолетовая радиация (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
  7. Затем мембрану подвергают воздействию гибридизационный зонд- единственный фрагмент ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК подлежит определению. ДНК зонда помечена так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивность или пометив молекулу флуоресцентный или же хромогенный краситель. В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть изготовлен из РНК, а не из ДНК. Чтобы обеспечить специфичность связывания зонда с образцом ДНК, в большинстве распространенных методов гибридизации используется ДНК спермы лосося или сельди для блокирования поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированной. формамиди моющие средства, такие как SDS для уменьшения неспецифического связывания зонда.
  8. После гибридизации избыток зонда смывают с мембраны (обычно с использованием Буфер SSC), а картина гибридизации визуализируется на рентгеновский снимок фильм по авторадиография в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда, или из-за появления цвета на мембране, если используется метод хромогенного обнаружения.

Результат

Гибридизация зонда с конкретным фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную зонду. Этап переноса ДНК из геля для электрофореза на мембрану позволяет легко связывать меченый гибридизационный зонд с фракционированная по размеру ДНК. Он также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа с помощью авторадиография или другие методы обнаружения. Саузерн-блоттинг, выполняемый с геномной ДНК, расщепленной рестрикционными ферментами, можно использовать для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геном. Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестрикционным ферментом, будет давать одну полосу на Саузерн-блоттинге, тогда как несколько полос, вероятно, будут наблюдаться, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, теми, которые может быть результатом дублирования последовательности). Модификация условий гибридизации (например, повышение температуры гибридизации или уменьшение концентрации соли) может использоваться для увеличения специфичности и уменьшения гибридизации зонда с последовательностями, которые менее чем на 100% похожи.

Приложения

Перенос саузерн-блоттинга может быть использован для клонирования на основе гомологии на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды спроектированы так, что они похожи на целевую последовательность. Олигонуклеотиды химически синтезированы, помечены радиоактивной меткой и используются для скрининга Библиотека ДНК, или другие коллекции клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с гибридизационным зондом, дополнительно анализируются, например, для получения полной последовательности целевого гена.

Саузерн-блоттинг также можно использовать для идентификации метилированных сайтов в определенных генах. Особенно полезны рестрикционные нуклеазы. MspI и HpaII, оба из которых распознают и расщепляют одну и ту же последовательность. Тем не мение, HpaII требует, чтобы C в этом сайте был метилирован, тогда как MspI расщепляет только неметилированную ДНК на этом участке. Следовательно, любые метилированные сайты в последовательности, анализируемой с помощью определенного зонда, будут расщепляться первым, но не вторым ферментом.[4]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Выявление специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии. 98 (3): 503–517. Дои:10.1016 / S0022-2836 (75) 80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  2. ^ Towbin; Стахелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения». PNAS. 76 (9): 4350–4. Дои:10.1073 / пнас.76.9.4350. ЧВК 411572. PMID 388439.
  3. ^ Бернетт, В. Нил (апрель 1981 г.). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфат-полиакриламид натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с использованием антител и радиоактивного йодированного белка А». Аналитическая биохимия. 112 (2): 195–203. Дои:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
  4. ^ Биохимия, 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, pg 977

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Саузерн-блот