WikiDer > Визуализация оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения

Визуализация оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI) - это метод постобработки для вычисления изображений со сверхвысоким разрешением из временных рядов записанных изображений, который основан на временных корреляциях независимо флуоресцентных излучателей.

SOFI был разработан для сверхвысокого разрешения биологических образцов, которые помечены независимо флуоресцентными излучателями (органические красители, флуоресцентные белки). По сравнению с другими микроскопия сверхвысокого разрешения такие методы, как БУРЯ или же ЛАДОНЬ которые полагаются на локализацию одной молекулы и, следовательно, допускают только одну активную молекулу на дифракционно-ограниченная область (DLA) и момент времени,^[1][2] SOFI не требует контролируемого фотопереключение и / или фотоактивация, а также длительное время визуализации.^[3][4] Тем не менее, для этого по-прежнему требуются флуорофоры, которые циклически проходят через два различимых состояния: реальные состояния включения / выключения или состояния с различной интенсивностью флуоресценции. С математической точки зрения создание изображений SOFI основывается на вычислении кумулянты, для чего существуют два различных способа. Во-первых, изображение можно рассчитать с помощью автокумулянтов.^[3] которые по определению полагаются только на информацию о каждом пикселе, и, во-вторых, улучшенный метод использует информацию о разных пикселях посредством вычисления перекрестных кумулянтов.^[5] Оба метода могут значительно увеличить окончательное разрешение изображения, хотя расчет кумулянта имеет свои ограничения. Фактически SOFI может увеличивать разрешение во всех трех измерениях.^[3]

Принцип

Принцип расчета автокумулянта SOFI (А) Схематическое изображение ПЗС-пиксельной сетки, содержащей несколько сигналов излучателей. (В) Вырезание двух флуорофоров с их сигналами, свёрнутыми с PSF системы, записанными в стеке изображений (С) Сигналы на каждом пикселе оцениваются кумулятивным вычислением (процесс, который можно понять с точки зрения корреляции и интегрирования).

Аналогично другим методам сверхвысокого разрешения SOFI основан на записи временного ряда изображения на камеру CCD или CMOS. В отличие от других методов регистрируемые временные ряды могут быть существенно короче, поскольку точная локализация излучателей не требуется, и поэтому допускается большее количество активированных флуорофоров на дифракционно-ограниченную область. Значения пикселей SOFI-изображения п-го порядка вычисляются из значений временного ряда пикселей в виде пкумулянт -го порядка, тогда как окончательное значение, присвоенное пикселю, можно представить как интеграл по корреляционной функции. Окончательно присвоенные значения интенсивности пикселей являются мерой яркости и корреляции сигнала флуоресценции. Математически пкумулянт -го порядка связан с пфункция корреляции -го порядка, но демонстрирует некоторые преимущества в отношении результирующего разрешения изображения. Поскольку в SOFI разрешено несколько излучателей на DLA, подсчет фотонов в каждом пикселе является результатом наложения сигналов всех активированных соседних излучателей. Кумулянтный расчет теперь фильтрует сигнал и оставляет только сильно коррелированные колебания. Это обеспечивает усиление контраста и, следовательно, уменьшение фона для хорошей меры. Как видно из рисунка слева, распределение источников флуоресценции:

${ displaystyle sum _ {k = 1} ^ {N} delta ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) cdot varepsilon _ {k} cdot s_ { k} (t)}$

сворачивается с функцией рассеяния точки системы (PSF) U(р). Следовательно, сигнал флуоресценции в момент времени t и положение ${ displaystyle { vec {r}}}$ дан кем-то

${ Displaystyle F ({ vec {r}}, t) = sum _ {k = 1} ^ {N} U ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) cdot varepsilon _ {k} cdot s_ {k} (t).}$

В рамках приведенных выше уравнений N количество эмиттеров, расположенных на позициях ${ displaystyle { vec {r}} _ {k}}$ с зависящей от времени молекулярной яркостью ${ displaystyle varepsilon _ {k} cdot s_ {k}}$ куда ${ displaystyle varepsilon _ {k}}$ - переменная для постоянной молекулярной яркости и ${ displaystyle s_ {k} (t)}$ - функция флуктуаций, зависящая от времени. Молекулярная яркость - это просто средняя скорость счета флуоресценции, деленная на количество молекул в определенной области. Для упрощения следует предположить, что образец находится в стационарном равновесии, и поэтому сигнал флуоресценции может быть выражен как флуктуация с нулевым средним:

${ displaystyle delta F ({ vec {r}}, t) = F ({ vec {r}}, t) - langle F ({ vec {r}}, t) rangle _ {t }}$

куда ${ Displaystyle langle cdots rangle _ {т}}$ обозначает усреднение по времени. Автокорреляция здесь, например. Тогда второй порядок может быть описан дедуктивно следующим образом для некоторого запаздывания ${ Displaystyle тау}$:

${ displaystyle delta F ({ vec {r}}, t) = langle delta F ({ vec {r}}, t + tau) cdot delta F ({ vec {r}}, t) rangle _ {t}}$

Из этих уравнений следует, что PSF оптической системы следует принимать в степени порядка корреляции. Таким образом, при корреляции второго порядка PSF будет уменьшена по всем измерениям в раз ${ displaystyle { sqrt {2}}}$. В результате разрешение SOFI-изображений увеличивается в соответствии с этим фактором.

Кумулянты против корреляций

Использование только простой функции корреляции для переназначения значений пикселей будет приписывать независимость флуктуаций излучателей во времени таким образом, что никакие члены взаимной корреляции не будут вносить вклад в новое значение пикселя. Вычисления корреляционных функций более высокого порядка будут страдать от корреляций более низкого порядка, по какой причине лучше вычислять кумулянты, поскольку все члены корреляции более низкого порядка исчезают.

Кумулянт-расчет

Автокумулянты

По причинам вычислений удобно установить все временные запаздывания в кумулянтах более высокого порядка равными нулю, чтобы общее выражение для пАвтокумулянт -го порядка можно найти:^[3]

${ displaystyle AC_ {n} ({ vec {r}}, tau _ {1 ldots n-1} = 0) = sum _ {k = 1} ^ {N} U ^ {n} ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) varepsilon _ {k} ^ {n} w_ {k} (0)}$

${ displaystyle w_ {k}}$ представляет собой весовую функцию, основанную на конкретной корреляции, на которую влияет порядок кумулянта и в основном зависит от флуктуационных свойств эмиттеров.

Хотя нет фундаментальных ограничений в вычислении очень высоких порядков кумулянтов и, таким образом, уменьшении FWHM PSF, существуют практические ограничения в зависимости от взвешивания значений, присвоенных окончательному изображению. Эмиттеры с более высокой молекулярной яркостью будут демонстрировать сильное увеличение с точки зрения значения кумулянта пикселей, назначенного на более высоких порядках, так же как эту производительность можно ожидать из-за разнообразного появления флуктуаций разных излучателей. Следовательно, можно ожидать широкого диапазона яркости результирующего изображения, и в результате тусклые излучатели могут маскироваться яркими излучателями на изображениях более высокого порядка:^[3][5] Расчет автокумулянтов может быть реализован очень привлекательно с математической точки зрения. В пКумулянт -го порядка может быть вычислен с помощью базовой рекурсии по моментам^[6]

${ displaystyle K_ {n} ({ vec {r}}) = mu _ {n} ({ vec {r}}) - sum _ {i = 1} ^ {n-1} { begin {pmatrix} n-1 i end {pmatrix}} K_ {ni} ({ vec {r}}) mu _ {i} ({ vec {r}})}$

где K - кумулянт порядка индекса, аналогично ${ displaystyle mu}$ представляет моменты. Термин в скобках указывает на биномиальный коэффициент. Этот способ вычисления более прост по сравнению с вычислением кумулянтов по стандартным формулам. Он позволяет вычислять кумулянты с минимальным временем вычислений и, поскольку он хорошо реализован, подходит даже для вычисления кумулянтов высокого порядка на больших изображениях.

Кросс-кумулянты

Принципы расчета кросс-кумулянта SOFI и коэффициента расстояния: (А) Расчет кросс-кумулянта 4-го порядка с «комбинациями с повторениями». (В) Коэффициент расстояния убывает по стрелкам.

В более продвинутом подходе кросс-кумулянты вычисляются с учетом информации нескольких пикселей. Кросс-кумулянты можно описать следующим образом:^[5][7]

${ displaystyle CC_ {n} ({ vec {r}}, tau _ {1 ldots n-1} = 0) = prod _ {j$

j, л и k индексы для участвующих пикселей, тогда как я это индекс для текущей позиции. Все остальные значения и индексы используются по-прежнему. Основным отличием при сравнении этого уравнения с уравнением для автокумулянтов является появление весового коэффициента ${ Displaystyle U (r_ {j} -r_ {l} / { sqrt {n}})}$. Этот весовой коэффициент (также называемый коэффициентом расстояния) имеет форму PSF и зависит от расстояния между взаимно коррелированными пикселями в том смысле, что вклад каждого пикселя уменьшается с увеличением расстояния в форме PSF. В принципе это означает, что коэффициент расстояния меньше для пикселей, которые находятся дальше друг от друга. Кросс-кумулянтный подход может использоваться для создания новых виртуальных пикселей, раскрывающих истинную информацию о меченом образце за счет уменьшения эффективного размера пикселя. Эти пиксели несут больше информации, чем пиксели, возникающие в результате простой интерполяции.

Кроме того, кросс-кумулянтный подход может использоваться для оценки PSF оптической системы путем использования разностей интенсивностей виртуальных пикселей, которые возникают из-за «потери» во взаимной корреляции, как упоминалось выше.^[5] Каждый виртуальный пиксель может быть повторно взвешен с обратной величиной коэффициента расстояния пикселя, что приведет к восстановлению истинного совокупного значения. Наконец, PSF можно использовать для создания зависимости разрешения п для пкумулянт -го порядка путем повторного взвешивания «оптической передаточной функции» (OTF).^[5] Этот шаг также можно заменить использованием PSF для деконволюции, что связано с меньшими вычислительными затратами.

Расчет кросс-кумулянта требует использования вычислительной гораздо более дорогой формулы, которая включает расчет сумм по разделам. Это, конечно, связано с комбинацией разных пикселей для присвоения нового значения. Следовательно, на данном этапе нельзя использовать быстрый рекурсивный подход. Для расчета перекрестных кумулянтов можно использовать следующее уравнение:^[8]

${ displaystyle K_ {n} { Bigg (} { vec {r}} = { frac {1} {n}} sum _ {i = 1} ^ {n} { vec {r_ {i} }} { Bigg)} = sum _ {P} (- 1) ^ {| P | -1} (| P | -1)! Prod _ {p in P} { Big langle} prod _ {i in p} F ({ vec {r}}) _ {i} { Big rangle} _ {t}}$

В этом уравнении п обозначает количество возможных разделов, п обозначает различные части каждого раздела. Кроме того я - индекс для разных положений пикселей, учитываемый при расчете, для чего F - это просто стек изображений различных участвующих пикселей. Кросс-кумулянтный подход облегчает генерацию виртуальных пикселей в зависимости от порядка кумулянта, как упоминалось ранее. Эти виртуальные пиксели могут быть вычислены по определенному шаблону из исходных пикселей для перекрестно-кумулянтного изображения 4-го порядка, как это показано на нижнем изображении, часть A. Сам шаблон возникает просто из расчета всех возможных комбинаций Пиксели исходного изображения A, B, C и D. Здесь это было сделано по схеме «комбинации с повторениями». Виртуальные пиксели демонстрируют потерю интенсивности из-за самой корреляции. Часть B второго изображения изображает эту общую зависимость виртуальных пикселей от взаимной корреляции. Чтобы восстановить значимые значения пикселей, изображение сглаживается процедурой, которая определяет коэффициент расстояния для каждого пикселя виртуальной пиксельной сетки в форме PSF и применяет обратное ко всем пикселям изображения, которые связаны с одним и тем же коэффициентом расстояния.^[5][7]

Рекомендации