WikiDer > Тандемная аффинная очистка

Tandem affinity purification
Taptag simple.png

Тандемная аффинная очистка (КРАН) является иммунопреципитация-основная методика очистки для изучения белок-белковые взаимодействия. Цель состоит в том, чтобы извлечь из клетки только интересующий белок, в комплексе с любые другие белки, с которыми он взаимодействовал. TAP использует два типа агароза шарики, которые связываются с интересующим белком и могут быть отделены от клеточный лизат центрифугированием, не нарушая, не денатурируя или не загрязняя вовлеченные комплексы. Чтобы интересующий белок мог связываться с шариками, он отмечен с дизайнерской частью, тегом TAP.

Оригинальный метод TAP включает слияние тега TAP в C-конец исследуемого белка. Тег TAP состоит из кальмодулин связывающий пептид (CBP) с N-конца, за которым следует Протеаза TEV сайт расщепления и два Белок А домены, которые тесно связаны с IgG (превращая тег TAP в тип эпитоп тег).

Многие другие комбинации меток / гранул / элюента были предложены с тех пор, как принцип TAP был впервые опубликован.

Теги вариантов

Этот тег также известен как тег TAP C-терминала, потому что N-концевой версия также доступна. Однако описываемый метод предполагает использование тега C-терминала, хотя принцип, лежащий в основе метода, остается тем же.

История

Тегирование TAP было изобретено исследовательской группой, работающей в Европейская лаборатория молекулярной биологии в конце 1990-х годов (Rigaut et al., 1999,[1] Puig et al., 2001[2]) и предложен в качестве нового инструмента для исследования протеома. Команда использовала его для характеристики нескольких белковых комплексов (Rigaut et al., 1999,[1] Caspary et al. 1999,[3] Bouveret et al., 2000,[4] Puig et al., 2001[2]). Первое крупномасштабное применение этой техники было в 2002 году, когда исследовательская группа работала в сотрудничестве с учеными из протеомической компании Cellzome, чтобы разработать визуальную карту взаимодействия более 230 мультибелковых комплексов в дрожжевой клетке путем систематического исследования. тегирование TAP-тега к каждому белку. Первое успешное сообщение об использовании технологии TAP tag на растениях появилось в 2004 году (Rohila et al., 2004,[5])

Процесс

Есть несколько методов, с помощью которых слитый белок можно ввести в клетки-хозяева. Если хост дрожжи, то одним из способов может быть использование плазмиды это в конечном итоге переведите слитый белок внутри хозяина. Какой бы метод ни использовался, предпочтительно поддерживать экспрессию гибридного белка как можно ближе к его естественному уровню. Как только гибридный белок транслируется внутри хозяина, он будет взаимодействовать с другими белками, в идеале таким образом, чтобы на него не влияла метка TAP.

Впоследствии меченый белок (с его партнерами по связыванию) извлекается с помощью близость процесс выбора.

Добавляемый первый тип шарика покрыт Иммуноглобулин G, который привязывается к самому внешнему концу тега TAP. Гранулы с представляющими интерес белками отделяются от лизата центрифугированием. Затем белки высвобождаются из гранул ферментом (Протеаза TEV), который разрывает метку на сайте расщепления TEV посередине.

После этой первой стадии очистки гранулы второго типа (покрытые кальмодулин) добавляется к высвободившимся белкам, который обратимо связывается с оставшейся частью тега TAP, все еще находящейся на белках. Гранулы снова разделяют центрифугированием, в результате чего удаляются загрязнения, а также протеаза TEV.[2] Наконец, бусины выпускаются EGTA, оставляя после себя нативный элюат, содержащий только интересующий белок, его связанные белки-партнеры и оставшуюся часть CBP метки TAP.

Затем нативный элюат можно проанализировать, используя гель-электрофорез и масс-спектрометрии для определения партнеров связывания белка.

Преимущества

Преимущество этого метода в том, что можно реально определять белковые партнеры количественно. in vivo без предварительного знания сложного состава. Он также прост в исполнении и часто обеспечивает высокую доходность.[2] Одним из препятствий при изучении взаимодействия белков с белками является загрязнение целевого белка, особенно когда у нас нет никаких предварительных сведений о нем. TAP предлагает эффективные и высокоспецифичные средства очистки целевого белка. После двух последовательных аффинных очисток вероятность удержания загрязняющих веществ в элюате значительно снижается.

Недостатки

Однако также существует вероятность того, что метка, добавленная к белку, может скрыть связывание нового белка с его взаимодействующими партнерами. Кроме того, метка также может влиять на уровни экспрессии белка. С другой стороны, метка также может недостаточно подвергаться воздействию аффинных гранул, что исказит результаты.

Также может существовать возможность расщепления белков Протеаза TEV, хотя это вряд ли произойдет часто, учитывая высокий специфичность протеазы TEV.[6]

Пригодность

Поскольку этот метод включает как минимум 2 цикла промывки, он может не подходить для проверки. временные белковые взаимодействия, в отличие от дрожжевой двугибридный метод или in vivo сшивание с фотореактивные аналоги аминокислот. Тем не менее, это хороший метод для тестирования стабильных белковых взаимодействий и позволяет проводить различные исследования, контролируя количество раз очистки белкового комплекса.[нужна цитата]

Приложения

В 2002 году тег TAP был впервые использован с масс-спектрометрией в крупномасштабном подходе для систематического анализа протеомика дрожжей, характеризуя мультибелковые комплексы.[7] В результате исследования выявлен 491 комплекс, из них 257 - совершенно новые. Остальные были знакомы по другим исследованиям, но теперь было обнаружено, что практически все они имеют новые компоненты. Они составили карту, связывающую все белковые компоненты функционально в сложной сети.

Многие другие протеомные анализы также включают использование TAP-тега. Исследование EMBO (Dziembowski, 2004) выявило новый комплекс, необходимый для удержания и сплайсинга ядерной пре-мРНК. Они очистили новый тримерный комплекс, состоящий из 3 других субъединиц (Snu17p, Bud13p и Pml1p), и обнаружили, что эти субъединицы не важны для жизнеспособности, но необходимы для эффективного сплайсинга (удаления интронов) пре-мРНК. В 2006 г. Fleischer et al. систематически идентифицированные белки, связанные с рибосомными комплексами эукариот.[8] Они использовали многогранный протеомный масс-спектрометрический скрининг для идентификации дрожжевых рибосомных комплексов, а затем использовали TAP-тегирование для функционального связывания всех этих белков.

Другие комбинации эпитоп-метка

Принцип тандемно-аффинной очистки мультибелковых комплексов не ограничивается комбинацией меток CBP и Protein A, используемой в оригинальной работе Rigaut et al. (1999). Например, комбинация FLAG- и HA-тегов используется с 2000 года группой Накатани. [9][10] для очистки многочисленных белковых комплексов из клеток млекопитающих. С момента публикации принципа TAP было предложено множество других комбинаций тегов.

Рекомендации

  1. ^ а б Rigaut G, et al. (1999). «Общий метод очистки белка для характеристики белковых комплексов и исследования протеома». Природа Биотехнологии. 17 (10): 1030–1032. Дои:10.1038/13732. PMID 10504710.
  2. ^ а б c d Puig, O .; и другие. (2001). «Метод тандемной аффинной очистки (TAP): общая процедура очистки белкового комплекса». Методы. 24 (3): 218–229. Дои:10.1006 / мет.2001.1183. PMID 11403571.
  3. ^ Caspary F, et al. (1999). «Частичная очистка дрожжевого U2 snRNP обнаруживает новый дрожжевой фактор сплайсинга пре-мРНК, необходимый для сборки пре-сплайсосом». Журнал EMBO. 18 (12): 3463–3474. Дои:10.1093 / emboj / 18.12.3463. ЧВК 1171425. PMID 10369685.
  4. ^ Bouveret E, et al. (2000). «Sm-подобный белковый комплекс, который участвует в деградации мРНК». Журнал EMBO. 19 (7): 1661–1671. Дои:10.1093 / emboj / 19.7.1661. ЧВК 310234. PMID 10747033.
  5. ^ Rohila, Jai S .; Чен, Мэй; Черни, Рональд; Фромм, Майкл Э. (февраль 2004 г.). «Улучшенная тандемная метка аффинной очистки и методы выделения гетерокомплексов белков из растений». Журнал растений. 38 (1): 172–181. Дои:10.1111 / j.1365-313X.2004.02031.x. PMID 15053770.
  6. ^ Догерти, W.G., S.M. Кэри и Т.Д. Паркс (1989). «Молекулярно-генетический анализ сайта расщепления полипротеина вируса растений: модель». Вирусология. 171 (2): 356–364. Дои:10.1016 / 0042-6822 (89) 90603-X. PMID 2669323.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  7. ^ Функциональная организация протеома дрожжей путем систематического анализа белковых комплексов, Гэвин А.С. и др. Природа 415, 141-147 (10 января 2002 г.) | Дои:10.1038 / 415141a; Поступило 15 августа 2001 г .; Принята в печать 25 октября 2001 г.
  8. ^ Систематическая идентификация и функциональный скрининг не охарактеризованных белков, связанных с рибосомными комплексами эукариот, DOI: 10.1101 / gad.1422006, Genes Dev. 2006. 20: 1294-1307.
  9. ^ Икура Т. и др. «Участие гистонацетилазного комплекса TIP60 в репарации ДНК и апоптозе». Клетка. 2000 102(4):463-73. [1]
  10. ^ Накатани Ю., Огрызко В. "Иммуноаффинная очистка белковых комплексов млекопитающих". Методы Энзимол. 2003;370:430-44.[2]