WikiDer > Зимоблот

Zymoblot

Зимоблот самый быстрый из доступных микротехника обнаружить экспрессия гена или ферментная активность в любом биологическом образце. Методика была изобретена профессором Эльсайед Эльсайед Вагих в сотрудничестве с профессором Жаклин Флетчер кафедры патологии растений, Благородный исследовательский центр, Государственный университет Оклахомы, США в 1993 году.[1]

Задний план

Физиологические явления на клеточном или молекулярном уровне в живые организмы прямо или косвенно движимы ферментативные реакции. Анализ фермент деятельность в живых организмах является одним из наиболее часто выполняемых видов деятельности в современном мире. физиология лаборатории. Многочисленные методы ферментные анализы доступны для количественного отслеживания ферментативных реакций. Эти методы сгруппированы в шесть категорий, а именно: спектрофотометрический, флуоресценция, нанометрический, электрод, поляриметрический,[2] радиобиохимический[3] без недостатков. Недавно появилась новая качественная или, скорее, полуколичественная микротехника, впервые описанная Вагихом и Флетчером (1993),[1] и термин «зимоблот» был введен для определения активности ферментов в спироплазмы и бактерии и многие другие биологические системы.[4][5] Позже методика была сделана количественной. денситометрия и успешно используется для мониторинга пероксидаза деятельность в вирус зараженные растения.[6]

Процедура

Всего 1 мкл или меньше образца достаточно для определения активности фермента методом зимоблота, поскольку окрашенный продукт нерастворимый, накапливается в ограниченном пространстве над местом обнаружения. Другие техники, основанные на колориметрия, может потребоваться больше аликвоты образца таким образом, чтобы количество образовавшихся окрашенных растворимых продуктов было достаточно большим для окрашивания содержимого анализа. кювета до колориметрически читаемого уровня.

У этой техники есть преимущества, которых нет ни у одной другой техники. Образцы для анализа с помощью зимоблота не требуют диализа (процесс, который может занять несколько дней), так как промывка блотов в Трис-буферный физиологический раствор (TBS) перед их маринованием в реакционной смеси удаляет ингибиторы. В отличие от других методов, в которых образцы анализируются индивидуально, образцы, подлежащие анализу с помощью зимоблота, наносятся на один и тот же блот, и активность фермента анализируется с той же реакционной смесью, в то же время минимизируя экспериментальные ошибки и обеспечивая быстрое качественное сравнение. Кроме того, несколько ферментов могут быть проанализированы в Последовательный порядок на том же пятне. То есть, если блот оказался отрицательным для определенного фермента, его можно промыть в TBS и повторно использовать для другого фермента и так далее, пока не будет получена положительная реакция на фермент. В отличие от влажных анализов (например, колориметрии), результаты, полученные с помощью зимоблота, всегда записываются в формате. Это позволяет проводить зимоблоты в одном месте, где денситометр могут быть недоступны и могут быть взяты или отправлены в другое место для количественного анализа с помощью денситометрии. Если взять зимоблот в кошелек исследователя на встречу, это облегчит обсуждение и обмен идеями с другими учеными. В то время как иммунологическиферментные анализы[3] который использует специфические для ферментов антитела прямое обнаружение ферментов страдает основным недостатком измерения «общего содержания ферментов», а не общей активности ферментов, зимоблот не является серологический метод, не использует антител и измеряет активность ферментов, поскольку определяет только активную (функциональную) часть общего содержания ферментов в образце.

Зимоблот - это тип анализа с конечной точкой, в котором ферментативной реакции позволяют протекать в течение фиксированного периода времени, прежде чем ее остановить путем быстрого устранения специфических субстрат. Однако метод может быть адаптирован для непрерывного ферментного анализа, когда интенсивность окраски отслеживают во времени путем инкубации сестринских блотов в течение постепенно увеличивающихся периодов времени. Когда на одном и том же блоте сравниваются разные образцы, реакцию следует останавливать на каком-то этапе линейной части протекания реакции. Об этом можно судить визуально, и реакция останавливается, когда становятся очевидными различия в интенсивности цвета пятен, учитывая, что продолжительность линейность у некоторых ферментов реакции действительно могут быть очень короткими.

Приложения

Метод Zymoblot проще, дешевле, надежнее и требует меньше времени, чем все известные процедуры ферментных анализов. Вероятно, это самый быстрый доступный метод определения активности ферментов в любом биологическом или даже небиологическом образце. Этот метод очень конкурентоспособен по цене со всеми имеющимися в продаже наборами. Такие преимущества должны квалифицировать технику Zymoblot для широкого потенциального использования в лекарство, сельское хозяйство и промышленная биотехнология и, шире, вообще биотехнология применение. Это полезно в исследованиях, включая физиологию людей, животных, растений и микроорганизмов, дифференциальный диагноз заболеваний и выявление патогены, биотаксономия организмов, стресса и патогенез физиология, физиологические основы устойчивость к болезням, физиология развития и скрининг коммерчески важных ферментов и многие другие приложения. Этот метод особенно полезен, когда требуется первоначальное тестирование активности ферментов. Его можно использовать в исследованиях, связанных со скринингом живого организма на наличие большого количества ферментов. Это также может быть очень полезно при обучении распределение ферментов или тканеспецифическая экспрессия гена с точки зрения активности фермента по всему телу или через орган. Образцы, взятые из разных частей организма или органа, можно одновременно анализировать и сравнивать на одном и том же блоте, что дает четкое представление о распределении активности фермента. С такой же простотой можно сравнивать соответствующие ткани, взятые у людей, подвергшихся нормальному и биотическому или абиотическому стрессу, для стимуляции или индукции ферментов. Кроме того, зимоблоты могут быть очень полезны в цитохимодиссекция исследования, направленные на локализацию ферментов внутри клеток. Фракции клеток, представляющие различные части клетки (ядра, митохондрии, лизосомы, пероксисомы, Тела Гольджи, цитозоль, ... и т. д.) можно проверить на наличие множества ферментов за относительно короткое время.

Качественный зимоблот имеет большой потенциал использования в диагностике человека, животных и растений. болезни. Если патоген демонстрирует определенный фермент, который не является общим для его хозяина, этот метод может стать окончательным диагностическим инструментом. Обнаружение фермента, который, как известно, обычно не присутствует в образце жидкость тела (например. сыворотка крови, CSF, синовиальная жидкость, молоко, слезы ... и т. д.) с использованием качественного зимоблота является показателем физиологическое расстройство, воспалительная реакция или патогенная инфекция. Во всех этих ситуациях количественный зимоблот может использоваться для определения серьезности проблемы. Аналогичным образом, замена биологических жидкостей небиологическими жидкостями, взятыми из водных объектов (или приготовленными из аналогичных источников окружающей среды) в разных местах или на разных глубинах в разное время, позволит зимоблоту посредством обнаружения активности ферментов выявлять или контролировать микробная нагрузка и, следовательно, определить уровень загрязнения этих источников.

использованная литература

  1. ^ а б Wagih, Elsayed E .; Флетчер, Жаклин (1993). «Зимоблот, новый микротехник, используемый для определения активности ферментов в спироплазмах и бактериях». Канадский журнал микробиологии. 39 (5): 543–547. Дои:10.1139 / m93-077.Вагих Э. Э. и Флетчер Дж. (1993). Зимоблот, новый микротехник, используемый для определения активности ферментов в спироплазмах и бактериях. Канадский журнал микробиологии 39: 543-547.
  2. ^ Диксон М. и Уэбб Э. К. (1979). Ферменты. 3-е изд. Longman Group Ltd. 1116стр.
  3. ^ а б Wiseman, A. [ed.] (1983). Темы биотехнологии ферментов и ферментации 7. Ellis Horwood Ltd. 314с.
  4. ^ Вагих, Э.Е. и Вагих, М.Э. (1996). Техника Зимоблота: потенциал в физиологии растений. Proc. 2-я Азиатско-Тихоокеанская конференция по физиологии растений, Шах-Алам, Куала-Лумпур, Малайзия, 20–22 августа 1996 г.
  5. ^ Вагих, М. Э., Онвуэме, И. К. и Вагих, Э. Э. (1996). Обнаружение дифференциальной экспрессии гена пероксидазы в таро (Colocasia esculenta L. Scotts) с использованием техники зимоблота. На 2-м Международном конгрессе по растениеводству. Нью-Дели, Индия, 17–24 ноября 1996 г.
  6. ^ Вагих, Э. Э. и Вагих, М. Э. (1997). Количественные методы зимоблота и белкового блота и их использование для мониторинга изменений общих ферментов и растворимых белков при вирусных инфекциях растений Proc. 1-я Всеафриканская конференция по растениеводству, Претория, Южно-Африканская Республика, 13-17 января 1997 г.

внешние ссылки