WikiDer > Метод стрелы

Метод стрелы (он же Метод экстракции нуклеиновой кислоты Boom) это твердофазная экстракция метод выделения нуклеиновая кислота из биологического образца. Этот метод характеризуется «поглощением нуклеиновых кислот (NA) на гранулах диоксида кремния».

Обзор

Метод Boom (метод экстракции нуклеиновых кислот Boom)^{[1][2][3][4][5][6][7][8]}это метод твердофазной экстракции для «выделения нуклеиновой кислоты (NA)^{[примечание 1][9]}из биологических образцов. Существенным в этом методе является использование гранул диоксида кремния, способных связывать NA в присутствии хаотропного вещества в зависимости от эффекта. Этот метод является одним из наиболее распространенных.^[6][7] методы выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов и известны как простые, быстрые и надежные^[2] метод мелкомасштабной очистки НА из биологического образца.

Считается, что этот метод был разработан и изобретен Виллем Р. Бум и другие. около 1990 г.^{[заметка 2]}Однако сам вышеупомянутый хаотропный эффект был уже известен и уже сообщался Фогельштейном и Гиллеспи.^{[10][заметка 3]} до разработки метода BOOM. Таким образом, вклад Boom et al. может быть оптимизация метода для сложных исходных материалов,^[1] такие как биологические жидкости и другие биологические исходные материалы, и обеспечивает процедуру коротких шагов в соответствии с Boom et al. US5234809.^[1] После Boom et al.^[1] подано, аналогичные заявки^[11][12][13] также были поданы другими сторонами.

В узком смысле слово «кремнезем» означало SiO.₂ кристаллы; однако доступны и другие формы частиц диоксида кремния. В частности, аморфный оксид кремния и стеклянный порошок, алкилсиликат, силикат алюминия (цеолит), или активированный кремнезем с -NH₂, являются подходящими в качестве связывающего нуклеиновую кислоту твердофазного материала в соответствии с этим способом. Сегодня широко используются варианты осуществления метода Бум, характеризующиеся «использованием магнитных шариков (шарики диоксида кремния - это магнитные шарики)». В таком методе гранулы диоксида кремния захватываются магнитным коллектором шариков, таким как пипетка Tajima,^[14][15][16] Выберите ручку (R),^[3][4]Четырехполюсный коллектор,^[17] и так далее.

Краткая процедура

Рис. 1: Метод штанги с помощью пипетки Tajima и шариков из магнитного кремнезема.^[14] Схематическая структура пипетки Tajima представлена ​​на рис. 2. Аппаратура и методы.^[14] в основном предназначены для иммунной системы. Однако в этом патенте также упоминается альтернативный вариант анализа экстракции нуклеиновых кислот, и процедура, показанная на фиг.1, в целом аналогична методу Boom.

Рис.2: Схематическая структура пипетки Tajima

Процесс выделения нуклеиновой кислоты из исходного материала по методу Бум по существу состоит из следующих 4 этапов.^[1][2][3][4] (См. Рис. 1).

(а) Лизинг и / или гомогенизация исходный материал.
Лизат исходного материала получают, например, с помощью детергента в присутствии ферментов, разрушающих белок.

(б) Смешивание хаотропное вещество и гранулы диоксида кремния в исходный материал.
Смешивание исходного материала, хаотропное вещество для связывания NA с гранулами диоксида кремния, лизат исходного материала (a) смешивают с достаточно большими количествами хаотропного вещества. В соответствии с хаотропным эффектом высвобождающаяся NA будет связываться с гранулами диоксида кремния почти мгновенно. Таким образом образуются комплексы кремнезем-нуклеиновая кислота. Причины, по которым формы NA и кремнезем должны быть описаны в следующем разделе (Основные принципы).

(c) Промывка шариков кремнезема
На этом этапе гранулы диоксида кремния (b) промывают несколько раз для удаления примесей. Процесс промывки комплексов диоксид кремния-нуклеиновая кислота (гранулы диоксида кремния) обычно состоит из следующих стадий:

• Сбор гранул диоксида кремния из жидкости, например, пипеткой Tajima (см. Рис. 1,2) или, например, Pellet-down (путем быстрого осаждения (центрифугирование) и удаления надосадочной жидкости (например, путем отсасывания))
• Повторное диспергирование гранул диоксида кремния в содержащем хаотропную соль промывочном буфере с использованием, e. г., вихревой смеситель.
• Снова сбор повторно диспергированных гранул диоксида кремния из вышеупомянутого промывочного буфера.
• Далее промывают последовательно водно-спиртовым раствором.^{[примечание 4]} и ацетоном.
• Бусины желательно сушить.

(г) Разделение связанных нуклеиновых кислот
Отделение связанных нуклеиновых кислот от гранул диоксида кремния. Чистая NA элюируется в буфер за счет уменьшения концентрации хаотропного вещества. ДНК, представленная в промытых (и предпочтительно высушенных) комплексах кремнезема и нуклеиновой кислоты, элюируется в буфер для элюирования, такой как буфер TE, аквабидест и т. Д. Выбор буфера для элюции определяется предполагаемым использованием выделенной NA.

Таким образом, чистая NA выделяется из исходного материала.

Изменением условий эксперимента, особенно изменением состава реагенты (хаотропное вещество, промывочный буфер и т. д.) мы можем реализовать более конкретную изоляцию. Например, какой-то состав реагентов подходит для получения длинной ds-ДНК, какой-то состав реагентов подходит для короткой ss-РНК и так далее.

Исходный материал, например, цельная кровь, сыворотка крови, охристая шерсть, моча, кал, спинномозговая жидкость, сперма, слюна, ткани, клеточные культуры, продукты питания, вакцина. и ..., поэтому доступны различные исходные биологические материалы.

Разумеется, необходима оптимизация процедуры в соответствии с исходным материалом, видами желаемой нуклеиновой кислоты (ДНК / РНК, линейная / кольцевая, ds / ss, длинная / короткая).

На сегодняшний день наиболее распространенным представляется анализ с использованием магнитных шариков, покрытых диоксидом кремния. Следовательно, в этой статье под «шариками из диоксида кремния» подразумеваются магнитные шарики, покрытые диоксидом кремния, если не указано иное.

Магнитные бусины

Гранулы с покрытием из диоксида кремния^[18][19][20] часто используются покрытые кремнеземом различные магнитные частицы (магнитный носитель).Маггемит частица (γ-Fe₂О₃) и магнетит частица (Fe₃О₄), а также его промежуточная частица оксида железа являются наиболее подходящими в качестве магнитного носителя.

Как правило, качество магнитных шариков характеризуется следующими параметрами:^[18][21]

• намагниченность насыщения (～ 10-80 А м2 / кг (эму / г):Суперпарамагнитный),^[18]
• коэрцитивная сила (～ 0,80-15,92 кА / м),^[18]
• размер диаметр (～ 0,1-0,5 мкм),^[18]
• масса каждой частицы (2,7 нг),^{[18][примечание 5]}
• простота сбора (будет упомянуто позже),^[18]
• способность захвата (будет упомянуто позже),^[18]
• Скорость оседания (～ 4% за 30 мин),^[21]
• Соотношение площадей (> 100 м²/грамм),
• Эффективная плотность (～ 2,5 г / см³), и
• Количество частиц (～ 1 х 10⁸ частиц / мг).^[21]

Здесь "простота сбора" определяется и сравнивается

«магнитные шарики собираются не менее чем X вес.% (～ 90 мас.%) в течение T секунд (3 секунд) в присутствии магнитного поля Y гаусс (3000 гаусс) когда он диспергирован в количестве не менее Z мг (～ 20 мг) в Вт · мл (～ 1 мл) водного раствора образца, содержащего биологическое вещество »

и способность захвата определяется и сравнивается

«связывание по крайней мере с A мкг (0,4 мкг) биологического вещества на B мг (1 мг) его, когда оно диспергировано в количестве не менее Z мг (20 мг) в Вт · мл (1 мл) водный раствор образца, содержащий биологическое вещество ».

Основные принципы

Принцип этого метода^{[1][2][3][4][14]} основан на свойствах связывания нуклеиновых кислот частиц диоксида кремния или диатомовых водорослей в присутствии этого хаотропного агента, которые согласно хаотропный эффект.

Проще говоря, хаотропный эффект заключается в том, что хаотропный анион в водном растворе нарушает структуру воды и ослабляет гидрофобное взаимодействие.^[22][23]

В широком смысле «хаотропный агент» обозначает любое вещество, способное изменять вторичную, третичную и / или четвертичную структуру белков и нуклеиновых кислот, но оставляя, по крайней мере, первичную структуру нетронутой.^[24]

Водный раствор хаотропной соли - хаотропный агент. Хаотропный анион увеличивает энтропия системы, препятствуя межмолекулярным взаимодействиям, опосредованным нековалентными силами, такими как водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные эффекты. Примерами являются водный раствор:тиоцианат-ион, ион йода, перхлорат-ион,нитрат-ион, ион брома,ион хлора, ацетат-ион, ион фтора, исульфат-ионили их взаимные комбинации. Согласно первоначальному методу Boom, используемая соль хаотропного гуанидиния предпочтительно представляет собой гуанидинтиоцианат (GuSCN).

По хаотропному эффекту в присутствии хаотропного агента гидратная вода НА отбирается из фосфодиэфирная связь из фосфатная группа скелета НА. Таким образом, фосфатная группа становится «открытой», и образуется гидрофобное взаимодействие между диоксидом кремния и открытой фосфатной группой.

Автоматизированные инструменты

Пипетка Tajima

Аппарат для экстракции нуклеиновых кислот на основе пипетки Tajima^[14][15] (см. рис. 2) являются одними из самых распространенных инструментов для выполнения метода стрелы.^[25]

Пипетка Tajima была изобретена Хидеджи Таджимой,^[14] основатель и президент компании Precision System Sciences (PSS)^[25] Inc., японского производителя прецизионных и измерительных инструментов. Пипетка Тадзима является ключевой технологией компании PSS Inc.^[25]PSS Inc. предоставляет OEM продукт на основе этой технологии (например, MagNA Pure (R)) для нескольких ведущих производителей реагентов, таких как Hoffmann-La Roche, Технологии жизни, ... и так далее. После того, как Tajima et al.^[14] были поданы аналогичные заявки, такие как^[16] также были поданы другими сторонами.

Пипетка Tajima выполняет метод и процедуру контроля магнитных частиц, которые могут отделять магнитные частицы, объединенные с целевым веществом, от жидкости с помощью магнитной силы и подвешивать их в жидкости.

Конфигурации

Сама пипетка представляет собой устройство, состоящее из следующих элементов (см. Рис. 2).^[14]

наконечник пипетки сконфигурирован, чтобы иметь возможность доступа и аспирации / слива жидкости из / в каждый из сосудов, имея

передняя часть,

часть резервуара,

жидкостный канал

соединение передней оконечной части и резервуарной части,

разделительная область

в жидкостном канале, подверженном действию магнитного поля, и

механизм

для приложения отрицательного или положительного давления к внутренней части части пипетки для всасывания или выпуска жидкости, взвешенной с магнитным веществом, в часть пипетки или из нее

Источник магнитного поля

расположен снаружи и рядом с наконечником пипетки; и

приводное устройство источника магнитного поля

для приведения в действие источника магнитного поля для приложения или удаления магнитного поля в или из области разделения снаружи канала для жидкости. Когда магнит приближается к наконечнику пипетки, создается магнитное поле; при отводе от наконечника пипетки это магнитное поле удаляется.

Аппарат для экстракции нуклеиновой кислоты, включающий пипетки Tajima, обычно состоит из:^[14]

Вышеупомянутый Пипетка Tajima,

Множественность трубы.

Множественность держатель трубки для вышеупомянутых трубок,

Транспортное средство

для транспортировки пипетки Tajima между этим множеством пробирок (пробирки поддерживаются держателем пробирок), и

Устройство управления

для управления вышеперечисленными устройствами.

Движения

(а) Захват магнитных шариков.
Во время этого процесса всасывания, когда магнитное поле прикладывается к области разделения наконечника пипетки снаружи наконечника пипетки с помощью магнита, расположенного снаружи наконечника пипетки, когда жидкость, содержащая магнитные шарики, проходит через область разделения пипетки. наконечника, магнитные частицы притягиваются и задерживаются на внутренней стенке области разделения плиток наконечника пипетки.

Впоследствии, когда этот раствор выпускают в условиях поддержания магнитного поля, только магнитные частицы остаются внутри наконечника пипетки. Таким образом магнитные частицы отделяются от жидкости.

Согласно Таджиме,^[14]предпочтительная высота всасывания смеси жидкости такова, чтобы

нижний уровень жидкости выше, чем нижний конец области разделения жидкостного канала (это означает, что нижний уровень жидкости выше, чем нижний конец магнита),

когда вся жидкая смесь набрана,

чтобы гарантировать, что всасываемые магнитные частицы могут быть полностью задержаны.

В это время, поскольку магнитные частицы влажные, они остаются прикрепленными к внутренней поверхности области разделения жидкостного канала наконечника пипетки. Если наконечник пипетки P перемещать или транспортировать, магнитные частицы не будут легко отрываться.

(b) Повторное подвешивание захваченных магнитных шариков.

После того, как магнитные частицы задерживаются вышеупомянутым способом (а),

таким образом, жидкая смесь, удаленная из магнитных частиц, выгружается в часть, вмещающую жидкость (сосуд), и сливается, при этом только магнитные частицы остаются в наконечнике пипетки,

мы можем сделать процесс повторной приостановки.

Повторное подвешивание захваченных магнитных шариков подробно описано, состоит из следующих этапов. Мы считаем, что это состояние, в котором этот магнитный материал был захвачен вышеуказанным способом.

• Аспирируйте жидкость, например промывочный буфер, в наконечник
• Прекратите применение магнитного поля

При «прекращении применения магнитного поля» магнитные частицы взвешиваются в жидкости.

• Слив жидкости (например, промывочного буфера) из наконечника пипетки в сосуд (в условиях отключения магнитной силы, создаваемой телом магнита).

Операции

Пример работы аппарата для экстракции нуклеиновой кислоты, который включает пипетку Тадзима, обычно такой, как показано на рисунке 1.

Другие методы

Примеры другого типа способа устройства улавливания магнитных частиц следующие.

• Захват типа пера^[3][4]
• Захват типа трубки^{[17][26][27][28]}

Смотрите также

• Хаотропный агент
• Извлечение ДНК
• Разделение ДНК путем адсорбции кремнезема
• Осаждение этанолом
• Очистка в мини-колонке
• Методы нуклеиновой кислоты
• Фенол-хлороформная экстракция
• Извлечение РНК

Примечания

Рекомендации