WikiDer > Библиотека CDNA
 | Эта статья нужны дополнительные цитаты для проверка. (Май 2008 г.) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения) |
А библиотека кДНК представляет собой комбинацию клонированной кДНК (комплементарная ДНК) фрагменты, вставленные в набор клеток-хозяев, которые составляют некоторую часть транскриптом организма и хранятся как "библиотека". кДНК производится из полностью транскрибированных мРНК найдено в ядро и поэтому содержит только выраженные гены организма. Аналогичным образом могут быть получены тканеспецифичные библиотеки кДНК. В эукариотический клетки зрелая мРНК уже сращенный, следовательно, полученная кДНК не содержит интроны и может быть легко экспрессирован в бактериальной клетке. Хотя информация в библиотеках кДНК является мощным и полезным инструментом, поскольку генные продукты легко идентифицируются, в библиотеках отсутствует информация о усилители, интроны, и другие регулирующие элементы, обнаруженные в библиотека геномной ДНК.
Создание библиотеки кДНК
кДНК создается из зрелого мРНК из эукариотической клетки с использованием обратная транскриптаза. У эукариот поли- (А) хвост (состоящий из длинной последовательности нуклеотидов аденина) отличает мРНК из тРНК и рРНК и поэтому может использоваться как грунтовка сайт обратной транскрипции. Проблема заключается в том, что не все расшифровки стенограмм, например гистон, закодировать поли-А хвост.
извлечение мРНК
Во-первых, мРНК получают и очищают от остальных РНК. Существует несколько методов очистки РНК, таких как тризол добыча и колоночная очистка. Очистку колонки проводят с использованием смол, покрытых олигомерными нуклеотидами dT, где будет связываться только мРНК, имеющая поли-А-хвост. Остальные РНК элюируются. МРНК элюируют с использованием буфера для элюирования и некоторого нагрева для отделения цепей мРНК от олиго-dT.
конструкция кДНК
После очистки мРНК, олиго-dT (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) помечена как комплементарный праймер, который связывается с поли-А-хвостом, обеспечивая свободный 3'-ОН конец, который может быть удлинен обратной транскриптазой для создания комплементарной цепи ДНК. Теперь мРНК удаляется с помощью РНКаза фермент, оставляющий одноцепочечную кДНК (оскДНК). Эта оскДНК превращается в двухцепочечную ДНК с помощью ДНК-полимераза. Однако для ДНК-полимеразы для синтеза комплементарной цепи необходим свободный 3'-ОН-конец. Это обеспечивается самой sscDNA путем создания петля для шпильки на 3 'конце, наматываясь на себя. Полимераза удлиняет 3'-ОН конец, и позже петля на 3'-конце открывается за счет ножничного действия S1 нуклеаза. Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигаза затем привыкли клон последовательности в бактериальные плазмиды.
Затем отбирают клонированные бактерии, обычно с помощью отбора антибиотиков. После выбора создаются запасы бактерий, которые позже можно выращивать и секвенировать для компиляции библиотеки кДНК.
Библиотека кДНК использует
Библиотеки кДНК обычно используются при воспроизведении геномов эукариот, поскольку объем информации сокращается для удаления большого количества некодирующих областей из библиотеки. Библиотеки кДНК используются для экспрессии эукариотических генов в прокариотах. Прокариоты не имеют интронов в своей ДНК и, следовательно, не обладают какими-либо ферментами, которые могли бы вырезать ее в процессе транскрипции. кДНК не имеет интронов и поэтому может экспрессироваться в прокариотических клетках. библиотеки кДНК наиболее полезны в обратная генетика где дополнительная геномная информация менее полезна. Кроме того, библиотеки кДНК часто используются в функциональное клонирование для идентификации генов на основе функции кодируемого белка. При изучении эукариотической ДНК библиотеки экспрессии конструируются с использованием комплементарной ДНК (кДНК), чтобы гарантировать, что вставка действительно является геном.[1]
Библиотека кДНК против библиотеки геномной ДНК
В библиотеке кДНК отсутствуют некодирующие и регуляторные элементы, обнаруженные в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более подробную информацию об организме, но их создание и хранение требуют больших ресурсов.
Клонирование кДНК
Молекулы кДНК можно клонировать с использованием линкеров сайтов рестрикции. Линкеры - это короткие двухцепочечные фрагменты ДНК (олигодезоксирибонуклеотид) длиной от 8 до 12 пар нуклеотидов, которые включают эндонуклеаза рестрикции сайт расщепления, например BamHI. Как кДНК, так и линкер имеют тупые концы, которые можно лигировать вместе с использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4. Затем в молекуле кДНК образуются липкие концы путем расщепления концов кДНК (которые теперь имеют линкеры со встроенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. А клонирование вектор (плазмида) затем также расщепляется соответствующей эндонуклеазой. Следующий "липкий конец«лигирование вставки в вектор, в который переносится полученная молекула рекомбинантной ДНК. Кишечная палочка клетка-хозяин для клонирования.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ П., Кларк, Дэвид (2009). Биотехнология: применение генетической революции. Паздерник, Нанетт Жан. Амстердам: Academic Press / Elsevier. ISBN 9780121755522. OCLC 226038060.