WikiDer > Колокализация

Colocalization

В флуоресцентная микроскопия, колокализация относится к наблюдению пространственного перекрытия между двумя (или более) разными флуоресцентными метками, каждая из которых имеет отдельную длину волны излучения, чтобы увидеть, находятся ли разные «мишени» в одной и той же области клетки или очень близко друг к другу. Это определение можно разделить на два разных явления: совместное возникновение, которое относится к присутствию двух (возможно, не связанных) флуорофоров в одном пикселе, и корреляция, гораздо более значимая статистическая взаимосвязь между флуорофорами, указывающая на биологическое взаимодействие.[1] Этот метод важен для многих клеточных биологических и физиологических исследований во время демонстрации взаимосвязи между парами биомолекул.

История

Способность продемонстрировать корреляцию между парой биомолекул была значительно расширена Эриком Мандерсом из Амстердамского университета, который представил Коэффициент корреляции Пирсона микроскопистам,[2] наряду с другими коэффициентами, из которых «коэффициенты перекрытия» M1 и M2 оказались наиболее популярными и полезными.[3][4] Цель использования коэффициентов - охарактеризовать степень перекрытия между изображениями, обычно двумя каналами в многомерном микроскопическом изображении, записанном на разных длинах волн излучения. Популярный подход был предложен Сильвеном Костесом, который использовал коэффициент корреляции Пирсона в качестве инструмента для объективной установки пороговых значений, необходимых для M1 и M2.[5] Подход Костеса предполагает, что интерес представляют только положительные корреляции, и не дает полезного измерения PCC.

Хотя использование коэффициентов может значительно повысить надежность обнаружения колокализации, это зависит от ряда факторов, включая условия того, как были приготовлены образцы с флуоресценцией и как были получены и обработаны изображения с колокализацией. Исследования следует проводить с большой осторожностью и после внимательного ознакомления с информацией. В настоящее время в этой области существует путаница, и стандартизированный подход еще не выработан.[6] Попытки исправить это включают повторную проверку и пересмотр некоторых коэффициентов,[7][8] применение коэффициента для коррекции шума,[1] «Репликация корреляций с поправкой на шум для точных измерений колокализации».[9] и предложение дальнейших протоколов,[10] которые были тщательно рассмотрены Болте и Кордельером (2006).[6] Кроме того, из-за того, что флуоресцентные изображения имеют тенденцию содержать определенное количество не в фокусе сигнала, пуассоновского взрыва и других шумов, они обычно требуют предварительной обработки перед количественной оценкой.[11][12] Тщательное восстановление изображения с помощью деконволюции удаляет шум и увеличивает контраст изображений, улучшая качество результатов анализа колокализации. До сих пор наиболее часто используемые методы количественной оценки колокализации вычисляли статистическую корреляцию интенсивностей пикселей в двух различных каналах микроскопии. Более поздние исследования показали, что это может привести к высоким коэффициентам корреляции даже для мишеней, которые, как известно, находятся в разных клеточных компартментах.[13] Более надежная количественная оценка совместной локализации может быть достигнута путем объединения распознавания цифровых объектов, вычисления перекрытия областей и комбинации со значением корреляции интенсивности пикселей. Это привело к концепции объектно-скорректированного коэффициента корреляции Пирсона.[13]

Примеры использования

Некоторые непроницаемые флуоресцентные цинковые красители могут заметно маркировать цитозоль и ядра из апоптирующий и некротизирующий клеток каждого из четырех различных типов ткани. А именно: кора головного мозга, то гиппокамп, то мозжечок, и также было продемонстрировано, что совместное обнаружение увеличения цинка и хорошо принятый индикатор клеточной гибели иодид пропидия также произошло в клетках почек. Использование принципов флуоресцентной колокализации. Было продемонстрировано одновременное обнаружение накопления цинка и поглощения йодида пропидия (традиционный индикатор гибели клеток) в нескольких типах клеток.[14] Различные примеры количественной оценки колокализации в области нейробиологии можно найти в обзоре.[15] Подробные протоколы количественной оценки колокализации можно найти в главе книги.[16]

Разрешение одной молекулы

Колокализация используется в флуоресцентной микроскопии одиночных молекул в реальном времени для обнаружения взаимодействий между флуоресцентно меченными молекулами. В этом случае один вид (например, молекула ДНК) обычно иммобилизуется на поверхности для визуализации, а другой вид (например, ДНК-связывающий белок) доставляется в раствор. Эти два вида помечены красителями спектрально разрешенных (> 50 нм) цветов, например цианин-3 и цианин-5. Возбуждение флуоресценции обычно осуществляется в режиме полного внутреннего отражения, который увеличивает отношение сигнал / шум для молекул на поверхности по сравнению с молекулами в объеме раствора. Молекулы обнаруживаются как пятна, появляющиеся на поверхности в режиме реального времени, и их местоположение определяется с точностью до 10-20 нм путем подбора функций рассеяния точки. Поскольку типичные размеры биомолекул составляют порядка 10 нм, этой точности обычно достаточно для вызова молекулярных взаимодействий. [17]

Интерпретация результатов

Для лучшей интерпретации результатов качественных и количественных исследований колокализации было предложено использовать набор из пяти лингвистических переменных, привязанных к значениям коэффициентов колокализации, таких как очень слаб, слабый, умеренный, сильный, и очень сильный, для их описания. Подход основан на использовании модели нечеткой системы и компьютерного моделирования. Когда вводятся новые коэффициенты, их значения могут быть включены в набор.[18]

Связанные методы

Контрольные изображения

Степень колокализации на изображениях флуоресцентной микроскопии может быть подтверждена с помощью Источник эталонного теста колокализации, бесплатная коллекция загружаемых наборов изображений с предопределенными значениями колокализации.

Программные реализации

Открытый исходный код

  • FIJI - это просто ImageJ - батарейки в комплекте
  • BioImage XD

закрытый исходный код

  • Модуль колокализации AxioVision
  • Программное обеспечение для исследования колокализации
  • CoLocalizer Pro CoLocalizer Pro
  • Модуль колокализации NIS-Elements от Nikon
  • Анализатор колокализации Huygens от Scientific Volume Imaging
  • Активность Quorum Technology
  • Image-Pro от Media Cybernetics
  • Имарис Bitplane
  • arivis Vision4D

Рекомендации

  1. ^ а б Адлер и другие. (2008)
  2. ^ Мандерс и др. (1992). «Динамика трехмерных паттернов репликации во время S-фазы, проанализированная с помощью двойного мечения ДНК и конфокальной микроскопии». [1]
  3. ^ Мандерс; и другие. (1993). «Измерение совместной локализации объектов на двухцветных конфокальных изображениях». Журнал микроскопии. 169 (3): 375–382. Дои:10.1111 / j.1365-2818.1993.tb03313.x.
  4. ^ Зинчук В. и др. (2007). «Количественный анализ колокализации многоцветных конфокальных изображений иммунофлуоресцентной микроскопии: использование пикселей для исследования биологических явлений». Acta Histochem Cytochem 40:101-111.
  5. ^ Костес и др. (2004) «Автоматическое и количественное измерение колокализации белок-белок в живых клетках». [2]
  6. ^ а б БОЛТ и КОРДЕЛЬИРЕС (2006) «Экскурсия по анализу субклеточной колокализации в световой микроскопии». [3]
  7. ^ Адлер и Пармрид (2010) «Количественная оценка колокализации по корреляции: коэффициент корреляции Пирсона превосходит коэффициент перекрытия Мандера». [4]
  8. ^ Краус и др. (2015). «Совместная локализация флуоресцентных и рамановских микроскопических изображений для идентификации субклеточных компартментов: валидационное исследование». Аналитик, том 140, выпуск 7, страницы 2360-2368. [5]
  9. ^ Adler, J .; Pagakis, S.N .; Пармрид, И. (1 апреля 2008 г.). «Корреляция с коррекцией шума на основе репликации для точных измерений колокализации». Журнал микроскопии. 230 (1): 121–133. Дои:10.1111 / j.1365-2818.2008.01967.x. PMID 18387047.
  10. ^ Curr Protoc Cell Biol «Количественный колокализационный анализ изображений конфокальной флуоресцентной микроскопии». В архиве 2009-11-28 на Wayback Machine
  11. ^ Поли Дж. Б. (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии
  12. ^ Зинчук В и др. (2011). «Количественная оценка пространственных корреляций флуоресцентных маркеров с использованием улучшенного снижения фона с помощью индекса близости белка и оценок коэффициента корреляции». Нат Проток 6:1554-1567.
  13. ^ а б Мозер, Бернхард; Хохрайтер, Бернхард; Хербст, Рут; Шмид, Йоханнес А. (01.07.2016). «Анализ флуоресцентной колокализационной микроскопии можно улучшить, объединив распознавание объектов с корреляцией интенсивности пикселей». Биотехнологический журнал. 12 (1): 1600332. Дои:10.1002 / biot.201600332. ISSN 1860-7314. ЧВК 5244660. PMID 27420480.
  14. ^ Аист, Кристиан Дж .; Ли, Ян В. (15 сентября 2006 г.). «Измерение жизнеспособности клеток с помощью непроницаемого для мембран цинк-флуоресцентного индикатора». Журнал методов неврологии. 155 (2): 180–186. Дои:10.1016 / j.jneumeth.2005.12.029. PMID 16466804.
  15. ^ Зинчук В., Гроссенбахер-Зинчук О. (2009). «Последние достижения в количественном анализе колокализации: фокус на нейробиологии». Программа Histochem Cytochem 44:125-172
  16. ^ "Adler J & Parmryd I (2013), методы Mol Biol 931, 97-109". Колокализационный анализ в флуоресцентной микроскопии. Получено 2016-04-19.
  17. ^ Геллес, Фридман Л. (17 февраля 2012 г.). «Механизм инициации транскрипции на активатор-зависимом промоторе, определяемый наблюдением одиночных молекул». Клетка. 148 (4): 635–637. Дои:10.1016 / j.cell.2012.01.018. ЧВК 3479156. PMID 22341441.
  18. ^ Зинчук, В; и другие. (2013). «Устранение разрыва между качественной и количественной колокализацией приводит к исследованиям флуоресцентной микроскопии». Научный представитель. 3: 1365. Дои:10.1038 / srep01365. ЧВК 3586700. PMID 23455567.