WikiDer > DARPin

DARPin

DARPins (ан акроним за разработаны белки с анкириновыми повторами) находятся генно-инженерный миметик антител белки как правило, проявляет высокую специфичность и сродство целевой белок привязка. Они получены из натуральных анкирин повторяющиеся белки, один из наиболее распространенных классов связывающих белков в природе, которые отвечают за различные функции, такие как передача сигналов, регуляция и структурная целостность клетки. DARPins состоят как минимум из трех, повторяющиеся мотивы или модули, из которых большинство N- и большинство C-концевых модулей упоминаются как «колпачки», поскольку они защищают гидрофобное ядро ​​белка. Количество внутренних модулей обозначается числом (например, N1C, N2C, N3C, ...), а колпачки обозначаются буквами «N» или «C» соответственно. В молекулярная масса например 14 или 18 кДа (килодальтон) для четырех- (N2C) или пяти- (N3C) повторов DARPins довольно мал для биологического препарата (около 10% от размера IgG).

DARPins представляют собой новый класс мощных, специфических и универсальных терапевтических средств на основе малых белков и используются в качестве исследовательских инструментов в различных исследованиях, диагностический и терапевтический Приложения.[1] Molecular Partners AG, биофармацевтическая компания клинической стадии, в которой несколько молекул DARPin находятся в клинической и доклинической разработке, в настоящее время занимается собственной разработкой терапевтических DARPin (прямая интеграция). Athebio AG развивает дальнейшее совершенствование каркаса DARPin для модель партнерства подход.

Происхождение, структура и поколение

DARPin с пятью мотивами анкириновых повторов (PDB: 2QYJ​)

Платформа DARPin была открыта и разработана в лаборатории Андреас Плюктун на Цюрихский университет, Швейцария при изучении инженерии и библиотек рекомбинантных антител.[2] DARPins получены из встречающихся в природе белков анкирина, класса белков, которые обеспечивают высокое сродство белок-белковые взаимодействия в природе.

Библиотеки DARPin были сконструированы путем выравнивания последовательностей нескольких тысяч мотивов естественных анкириновых повторов (примерно 33 аминокислоты каждый) в сочетании со структурным дизайном и рекомбинантная ДНК методы.[2] Эти белки состоят из повторяющихся структурных единиц, которые образуют стабильную белковый домен с большой потенциальной поверхностью взаимодействия с мишенью. Обычно DARPins содержат четыре или пять повторов, из которых первый (N-кэпирующий повтор) и последний (C-кэпирующий повтор) служат для защиты гидрофобного белкового ядра от водной среды. DARPins соответствуют среднему размеру доменов белка с естественными анкириновыми повторами. Белки с менее чем тремя повторами (т. Е. Кэппинговые повторы и один внутренний повтор) не образуют достаточно стабильного третичная структура.[3] Молекулярная масса DARPin зависит от общего количества повторов, как показано на следующей диаграмме:

Повторяется34567...
Приблизительная масса (кДа)1014182226...

Библиотеки DARPin с рандомизированными потенциальными остатками взаимодействия с мишенью, с разнообразием более 1012 варианты, были созданы на уровне ДНК. Из этих библиотек биохимики могут выбрать DARPins для связывания выбранной мишени с пикомолярным близость и специфичность можно выбрать с помощью рибосомный дисплей[4] или же фаговый дисплей[5] с использованием сигнальных последовательностей, обеспечивающих котрансляционную секрецию.[6] Пины DARPin могут выступать в качестве агонисты рецепторов, антагонисты, обратные агонисты, ингибиторы ферментов, или простые связывающие белки-мишени.[1]

Свойства и потенциальные преимущества DARPins

DARPins выражаются в цитоплазма из кишечная палочка при высоких уровнях (более 10 г / л при ферментации, 1 г / л во встряхиваемой колбе) в растворимый форма.[7] Белки обладают высокой термической и термодинамическая стабильность (средняя точка денатурации: обычно установление равновесия: ∆G> 9,5ккал / моль) увеличивается с увеличением числа повторов.[2][8][9] DARPins стабильны в организме человека сыворотка крови и может быть спроектирован так, чтобы не содержать Т-клетка эпитопы.

Благодаря высокой специфичности, стабильности, эффективности и аффинности, а также их гибкой архитектуре, DARPins имеют жесткое тело-обвязочный режим.[1][4] Мультиспецифические или поливалентные конструкции, полученные путем генетического слияния, предполагают, что слитые DARP-пины обладают сходными связывающими свойствами с однодоменными DARP-пинами.[1] Отсутствие цистеины в каркасе позволяет конструировать сайт-специфические цистеины, позволяя сайт-направленное связывание химических веществ с молекулой. С той же целью можно вводить неприродные аминокислоты.[10]

Потенциально, DARPins могут обеспечить клиническую пользу, преодолевая ограничения традиционных терапевтических подходов, которые обычно нацелены на один путь заболевания и, таким образом, могут снизить эффективность. Во многих случаях сложность заболевания возникает из-за нарушения регуляции нескольких путей. Технология DARPin может быть использована для быстрого создания тысяч различных «мульти-DARPin», в которых связываются домены связывания (т.е. линкерами), что позволяет нацеливать несколько путей заболевания. Пины DARPin и мульти-DARPin также могут быть объединены с элементами, не относящимися к DARPin, такими как токсин,[11] для создания целевых терапевтических средств, и их производству способствует устойчивость DARPin к агрегации. Разнообразие форматов и надежность мульти-DARPin облегчает эмпирический подход (например, с помощью скрининга на основе результатов) для эффективной идентификации DARPins с потенциальной активностью в конкретных путях заболевания.

Потенциальные преимущества DARPin во многом связаны с их структурными и биофизическими характеристиками. Считается, что их небольшой размер (14-18 кДа) способствует увеличению проникновения в ткани, а их высокая эффективность (<5-100 пМ) делает DARPin активными при низких концентрациях.[12] DARPины растворимы при концентрации> 100 г / л, и их высокая стабильность и растворимость считаются желательными свойствами для лекарственных соединений. DARPin можно производить быстро и экономично (т. Е. Из Кишечная палочка). Их фармакокинетические (PK) свойства можно регулировать путем слияния с молекулами, увеличивающими период полужизни, такими как полиэтиленгликоль (PEG), или с DARPins, связывающимися с сывороточным альбумином человека. Благодаря своим благоприятным биофизическим свойствам,[1] DARPins считаются легко развиваемыми с использованием стандартных процессов, потенциально демонстрируя устойчивое поведение класса.

Клинические разработки и приложения

DARPins использовались в качестве инструментов исследования,[1] как диагностические агенты[12] и в качестве терапевтических агентов.[13][14][15][16] MP0112, первый кандидат DARPin в клинике, является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и вступил в клинические испытания для лечения влажная возрастная дегенерация желтого пятна (влажная AMD, также известная как неоваскулярная возрастная дегенерация желтого пятна)[11] и диабетический макулярный отек[17] в начале 2010 г.

В настоящее время MP0112 исследуется в трех различных клинических испытаниях. Первые два испытания - это исследования безопасности и эффективности у пациентов с влажной AMD, чтобы установить сопоставимость между пациентами из Японии и других стран.[13][15] Третье исследование предназначено для проверки безопасности и эффективности препарата у пациентов с ДМО.[14]

В июле 2014 года Molecular Partners инициировала первое исследование на людях для изучения безопасности, переносимости и уровней в крови MP0250, второго кандидата DARPin, у онкологических пациентов.[16]

Molecular Partners AG имеет несколько дополнительных DARPin в доклинической разработке с потенциальными показаниями для лечения различных заболеваний, включая офтальмология, онкология, иммуноонкология и иммунология.

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж Plückthun A (2015). «Разработанные белки с анкириновыми повторами (DARPins): связывающие белки для исследований, диагностики и терапии». Анну. Rev. Pharmacol. Токсикол. 55 (1): 489–511. Дои:10.1146 / annurev-pharmtox-010611-134654. PMID 25562645.
  2. ^ а б c Binz HK, Stumpp MT, Forrer P, Amstutz P, Plückthun A (сентябрь 2003 г.). «Создание повторяющихся белков: хорошо экспрессируемые, растворимые и стабильные белки из комбинаторных библиотек консенсусных белков с анкириновыми повторами». Журнал молекулярной биологии. 332 (2): 489–503. CiteSeerX 10.1.1.627.317. Дои:10.1016 / S0022-2836 (03) 00896-9. PMID 12948497.
  3. ^ Мосави, Л. К .; Минор, Д. Л .; Пэн, З. -Й. (2002). «Полученные консенсусом структурные детерминанты мотива анкиринового повтора». Труды Национальной академии наук. 99 (25): 16029–16034. Bibcode:2002ПНАС ... 9916029М. Дои:10.1073 / pnas.252537899. ЧВК 138559. PMID 12461176.
  4. ^ а б Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grütter MG, Plückthun A (май 2004 г.). «Связывающие вещества с высоким сродством, выбранные из разработанных библиотек белков с анкириновыми повторами». Природа Биотехнологии. 22 (5): 575–582. Дои:10.1038 / nbt962. PMID 15097997.
  5. ^ Штайнер Д., Форрер П., Плюктхун А. (2008). «Эффективный выбор DARPin с субнаномолярным сродством с использованием SRP Phage Display» (PDF). Мол. Биол. 382 (5): 1211–1227. Дои:10.1016 / j.jmb.2008.07.085. PMID 18706916.
  6. ^ Штайнер Д., Форрер П., Штумпп М. Т., Плюктхун А. (май 2006 г.). «Сигнальные последовательности, управляющие котрансляционной транслокацией, расширяют диапазон белков, поддающихся фаговому дисплею». Природа Биотехнологии. 24 (7): 823–831. Дои:10.1038 / nbt1218. PMID 16823375.
  7. ^ Данные в файле. Molecular Partners AG.
  8. ^ Коль А., Бинц Х. К., Форрер П., Штумпп М. Т., Плюктхун А., Грюттер М. Г. (май 2003 г.). «Разработан, чтобы быть стабильным: кристаллическая структура консенсусного белка с анкириновыми повторами». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 100 (4): 1700–1775. Bibcode:2003ПНАС..100.1700К. Дои:10.1073 / pnas.0337680100. ЧВК 149896. PMID 12566564.
  9. ^ Ветцель С.К., Сеттанни Дж., Кениг М., Бинц Г.К., Плюктхун А. (февраль 2008 г.). "Механизм сворачивания и разворачивания высокостабильных белков с анкириновыми повторами полного консенсуса" (PDF). Журнал молекулярной биологии. 376 (1): 241–257. Дои:10.1016 / j.jmb.2007.11.046. PMID 18164721.
  10. ^ Саймон М., Фрей Р., Зангемейстер-Виттке У., Плюктхун А (2013). «Ртогональная сборка сконструированного конъюгата белок-цитотоксин анкиринового повтора с интерактивным модулем сывороточного альбумина для увеличения периода полужизни». Биоконъюгат Chem. 24 (2): 1955–1966. Дои:10.1021 / bc200591x. PMID 22188139.
  11. ^ а б Мартин-Киллиас П., Стефан Н., Ротшильд С., Плюктхун А., Зангемейстер-Виттке У. (2011). «Новый слитый токсин, полученный из белка анкиринового повтора, специально созданного для EpCAM, обладает сильной противоопухолевой активностью». Clin. Рак Res. 17 (1): 100–110. Дои:10.1158 / 1078-0432.CCR-10-1303. PMID 21075824.
  12. ^ а б Захнд С., Каве М., Штумпп М.Т., де Паскуале С., Тамаскович Р., Надь-Давидеску Г., Драйер Б., Шибли Р., Бинц Г.К., Вайбель Р., Плюктхун А. (2010). «Эффективное нацеливание на опухоль с помощью белков анкириновых повторов с высоким сродством: влияние сродства и размера молекулы». Рак Res. 70 (4): 1595–1605. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-09-2724. PMID 20124480.
  13. ^ а б Номер клинического исследования NCT02181517 для «Исследования Abicipar Pegol у пациентов с неоваскулярной возрастной дегенерацией желтого пятна» в Clinicaltrials.gov.
  14. ^ а б Номер клинического исследования NCT02186119 за «Исследование Abicipar Pegol у пациентов с диабетическим макулярным отеком» в Clinicaltrials.gov.
  15. ^ а б Номер клинического исследования NCT02181504 за «Исследование Abicipar Pegol у японских пациентов с неоваскулярной возрастной дегенерацией желтого пятна» в Clinicaltrials.gov.
  16. ^ а б Номер клинического исследования NCT02194426 для первого исследования на людях по изучению безопасности, переносимости и уровней в крови тестируемого препарата MP0250 у онкологических больных »в Clinicaltrials.gov.
  17. ^ Номер клинического исследования NCT01042678 за "Исследование интравитреальной инъекции MP0112 у пациентов с диабетическим отеком макулы" в ClinicalTrials.gov