WikiDer > FAIRE-Seq

FAIRE-Seq (FормальдегидАssisted яутешение ррегулирующий Elements) - это метод в молекулярная биология используется для определения последовательностей участков ДНК в геном связанные с регулирующей деятельностью.^[1] Методика была разработана в лаборатории Джейсона Д. Либа в Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл. В отличие от ДНКаза-Seqпротокол FAIRE-Seq не требует пермеабилизации клеток или выделения ядер и может анализировать любой тип клеток. В исследовании семи различных типов клеток человека DNase-seq и FAIRE-seq дали сильную перекрестную проверку, при этом каждый тип клеток имеет 1-2% открытого генома человека. хроматин.

Рабочий процесс

Протокол основан на том, что формальдегид сшивание более эффективно в нуклеосома-граница ДНК чем в областях генома, лишенных нуклеосом. Затем этот метод отделяет несшитую ДНК, которая обычно находится в открытом хроматине, которая затем секвенируется. Протокол состоит из перекрестного связывания, экстракции фенолом и секвенирования ДНК в водной фазе.

FAIRE

FAIRE использует биохимические свойства связанной с белком ДНК для разделения областей генома, лишенных нуклеосом. Клетки будут подвергнуты перекрестному связыванию, гарантируя, что взаимодействие между нуклеосомами и ДНК зафиксировано. После обработки ультразвуком фрагментированную и фиксированную ДНК разделяют с помощью экстракции фенол-хлороформ. Этот метод создает две фазы: органическую и водную фазы. Благодаря своим биохимическим свойствам фрагменты ДНК, сшитые с нуклеосомами, будут предпочтительно находиться в органической фазе. С другой стороны, истощенные нуклеосомы или «открытые» области будут обнаружены в водной фазе. Путем специальной экстракции водной фазы будут очищены и обогащены только области, лишенные нуклеосом.^[1]

Последовательность действий

Фрагменты ДНК, выделенные FAIRE, можно анализировать высокопроизводительным способом, используя секвенирование следующего поколения техники. Как правило, библиотеки создаются путем лигирования конкретных адаптеров к фрагментам ДНК, которые позволяют им группироваться на платформе и амплифицироваться, что приводит к считыванию / определению последовательностей ДНК, и это параллельно для миллионов фрагментов ДНК.

В зависимости от размера генома, на котором выполняется FAIRE-seq, требуется минимум операций чтения, чтобы создать соответствующий охват данных, гарантирующий, что можно определить правильный сигнал.^[2][3] Кроме того, эталонный или входной геном, который не был перекрестно связан, часто секвенируется вместе с целью определения уровня фонового шума.

Обратите внимание, что извлеченные фрагменты FAIRE могут быть количественно определены альтернативным методом, используя количественная ПЦР. Однако этот метод не позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку извлеченных фрагментов в масштабе всего генома.

Чувствительность

Есть несколько аспектов FAIRE-seq, которые требуют внимания при анализе и интерпретации данных. Во-первых, было заявлено, что FAIRE-seq будет иметь больший охват энхансерных областей по сравнению с промоторными областями.^[4] Это контрастирует с альтернативным методом ДНКазы-seq, который, как известно, проявляет более высокую чувствительность к промоторным областям. Кроме того, было заявлено, что FAIRE-seq показывает предпочтение для внутренних интронов и экзонов.^[5] В целом также считается, что данные FAIRE-seq отображают более высокий уровень фона, что делает этот метод менее чувствительным.^[6]

Вычислительный анализ

На первом этапе данные FAIRE-seq сопоставляются с эталонным геномом используемого модельного организма.

Затем идентификация участков генома с открытым хроматином выполняется с использованием алгоритма вызова пика. Различные инструменты предлагают пакеты для этого (например, ChIPOTle^[7] ЗИНБА^[8] и MACS2^[9]). ChIPOTle использует скользящее окно размером 300 п.п. для выявления статистически значимых сигналов. Напротив, MACS2 идентифицирует обогащенный сигнал, комбинируя параметр callpeak с другими опциями, такими как «широкий», «широкий отсечение», «без модели» или «сдвиг». ZINBA - это общий алгоритм для обнаружения обогащения в наборе данных для короткого чтения.^[10] Таким образом, это помогает в точном обнаружении сигнала в сложных наборах данных с низким отношением сигнал / шум.

КроватьИнструменты^[11] используется для слияния обогащенных областей, расположенных близко друг к другу, с образованием COREs (кластер открытых регуляторных элементов). Это помогает идентифицировать доступные для хроматина области и паттерны регуляции генов, которые в противном случае были бы необнаружимы, учитывая, что FAIRE-seq часто приносит с собой более низкое разрешение.

Данные обычно визуализируются в виде треков (например, bigWig) и могут быть загружены в браузер генома UCSC.^[12]

Основное ограничение этого метода, то есть низкое отношение сигнал / шум по сравнению с другими анализами доступности хроматина, делает вычислительную интерпретацию этих данных очень сложной.^[13]

Альтернативные методы

Есть несколько методов, которые можно использовать как альтернативу FAIRE-seq. DNase-seq использует способность фермента ДНКазы I расщеплять свободную / открытую / доступную ДНК для идентификации и секвенирования открытого хроматина.^[14][15] Впоследствии развитые ATAC-seq использует транспозазу Tn5, которая вставляет определенные фрагменты или транспозоны в доступные области генома для идентификации и секвенирования открытого хроматина.^[16]

Рекомендации