WikiDer > Рекомбинация FLP-FRT

FLP-FRT recombination
Сайт-специфическая рекомбиназа Flp
Идентификаторы
ОрганизмSaccharomyces cerevisiae
СимволFLP1
UniProtP03870
Упрощенный механизм рекомбиназы Flp-FRT.png

В генетика, Flp-FRT рекомбинация это сайт-направленная рекомбинация технология, которая все чаще используется для управления ДНК организма в контролируемых условиях in vivo. Это аналог Cre-лох рекомбинация но включает рекомбинацию последовательностей между мишенью распознавания короткой флиппазы (FRT) сайтов рекомбиназа флиппаза (Flp), полученный из плазмиды 2 мк пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

Последовательность минимального сайта FRT из 34 пар оснований имеет последовательность

5'GAAGTTCCTATTCtctagaaaгтATAGGAACTTC3'

для которого флиппаза (Flp) связывается с обеими плечами 5'-GAAGTTCCTATTC-3 'из 13 п.н., фланкирующими спейсер из 8 п.н., т.е. сайт-специфическая рекомбинация (область кроссовера) в обратной ориентации. FRT-опосредованное расщепление происходит сразу перед асимметричной коровой областью 8 п.н. (5'tctagaaa3') на верхней пряди и за этой последовательностью на нижней пряди.[1] Несколько вариантов FRT сайты существуют, но рекомбинация обычно может происходить только между двумя идентичный FRTs, но обычно не среди не идентичны («гетероспецифический») FRTс.[2][3]

Биологическая функция

У дрожжей этот фермент корректирует уменьшение числа копий плазмиды 2 мкм, вызванное редкими случаями неправильной сегрегации. Это происходит за счет рекомбинации между двумя перевернутыми повторами на плазмиде 2 мкм во время Репликация ДНК. Это изменяет направление одной ветви репликации, вызывая несколько раундов копирования за одну инициацию.[4]

Мутации последовательности сайта FRT

Сенеков и другие. (1987) исследовали, как нуклеотидные замены в FRT влияют на эффективность FLP-опосредованной рекомбинации. Авторы индуцировали замены оснований в одном или обоих сайтах FRT и тестировали концентрацию FLP, необходимую для наблюдения сайт-специфических рекомбинаций. Каждую замену оснований выполняли на каждом из тринадцати нуклеотидов в пределах сайта FRT (пример G на A, T и C). Во-первых, авторы показали, что большинство мутаций в последовательности FRT вызывают минимальные эффекты, если присутствуют только в одном из двух сайтов. Если мутации произошли в обоих сайтах, эффективность FLP резко снижается. Во-вторых, авторы предоставили данные о том, какие нуклеотиды наиболее важны для связывания FLP и эффективности сайт-специфической рекомбинации. Если первый нуклеотид в обоих сайтах FRT заменен на цитозин (с G на C), третий нуклеотид заменен на тимин (от A до T) или седьмой нуклеотид заменен на аденозин (с G на A), тогда Эффективность FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации снижается более чем в 100 раз.[5] В то время как замена основания любого из вышеупомянутых нуклеотидов только в одном из сайтов FRT приводила к десятикратному, десятикратному и пятикратному снижению эффективности соответственно.[5]

Замены оснований в нуклеотидах, начисленных с заглавной буквы, привели к наибольшему снижению FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации (мутант дикого типа x и мутант x мутант):

5'GaAtagGaacttc3'[5]

Многие доступные конструкции включают дополнительные последовательности плеч (5'-GAAGTTCCTATTCC-3 ') на одну пару оснований от предшествующего элемента и в той же ориентации:

5'GAAGTTCCTATTCcGAAGTTCCTATTCtctagaaaгтATAGGAACTTC3'

Этот сегмент необязателен для удаления, но необходим для интеграции, в том числе Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой.[6]

Поскольку активность рекомбинации может быть нацелена на выбранный орган, или низкий уровень активности рекомбинации может использоваться для последовательного изменения ДНК только подмножества клеток, Flp-FRT можно использовать для построения генетическая мозаика в многоклеточных организмах. С помощью эта технологияпотеря или изменение гена может быть изучена в данном интересующем органе-мишени даже в тех случаях, когда экспериментальные животные не переживут потерю этого гена в других органах (пространственный контроль). Эффект изменения гена также можно изучить с течением времени, используя индуцибельный промотор запускать рекомбинационную активность на поздних стадиях развития (временный контроль) - это предотвращает переделку.

Биохимическая структура Флп и механизм действия

Биохимически релевантная структура и активный сайт

Белок Flp, как и Cre, представляет собой сайт-специфическую рекомбиназу семейства тирозина.[7] Это семейство рекомбиназ выполняет свою функцию через механизм топоизомеразы типа IB, вызывая рекомбинацию двух отдельных цепей ДНК.[7] Рекомбинация осуществляется повторяющимся двухэтапным процессом. Первый шаг вызывает создание Холлидей Джанкшн промежуточный. Второй шаг способствует результирующей рекомбинации двух комплементарных цепей. Как следует из их фамилии, высококонсервативный тирозиновый нуклеофил расщепляет нити ДНК.[7] Нуклеофильные свойства тирозина атакуют и связываются с 3'-фосфатом в точке расщепления ДНК.[7] Образовавшаяся 5'-гидроксильная группа расщепленной ДНК действует как нуклеофил и атакует 3'-фосфат на комплементарно расщепленной цепи ДНК, что приводит к успешной рекомбинации.[7] Помимо остатка тирозина существует консервативная каталитическая пентада. Эта пентада состоит из лизина (Lysβ), двух аргининов (Arg I и II), гистидина (His-II) и гистидина / триптофана (His / Trp-III), который составляет обязательную и высококонсервативную совокупность остатки активного центра Flp и Cre (наряду с другими топиосомеразами IB).[7] Эти другие остатки имеют решающее значение для правильной ориентации связывания Flp и позиционирования на нитях ДНК.

Применение FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации

Начальные проблемы

Термолабильность

Первоначальное применение рекомбиназы FLP-FRT не помогло млекопитающим. Белок FLP был термолабильный (денатурируется при повышенных температурах) и поэтому не может использоваться в модели на млекопитающих из-за повышенной температуры тела этих модельных систем. Однако из-за патентов и ограничений на использование рекомбинации Cre-Lox был проявлен большой интерес к созданию более термостабильной кассеты FLP-FRT. Некоторые из первых результатов были получены Бухгольцем. и другие. (1997) с помощью езды на велосипеде мутагенез в кишечная палочка . В своем исследовании авторы трансфицировали E. coli cells с двумя плазмидами: одна кодирует случайно мутированные белки FLP ниже промотора арабинозы, а другая содержит промотор гена lacZ в кассете FRT. В Кишечная палочка были выращены на чашках с арабинозой при 37 ° C и 40 ° C, и если произойдет рекомбинация, экспрессия lacZ будет ослаблена, и колонии будут выглядеть белыми. Белые колонии отбирали из каждого поколения и выращивали на новых чашках с арабинозой при прежних температурах в течение восьми поколений.[8] После подтверждения рекомбинации вестерн-блоттингом и секвенирования мутантных генов FLP это евосьмое поколение ФЛП белок (FLPe) трансфицировали в культуру клеток млекопитающих, и рекомбинация в клетках млекопитающих была подтверждена.[8] Этот вариант FLP имеет только 4 аминокислотные замены: P2S, L33S, Y108N и S294P.

Генерация генетической мозаики

Генетический мозаицизм происходит в организме, когда похожие типы клеток выражают разные фенотипы из-за несходных генотипов в определенных локусах. Проще говоря, это происходит, когда один организм содержит разные генотипы, что обычно бывает редко в природе. Однако это может быть легко (и проблематично) произведено с помощью рекомбинации FLP-FRT. Если в клетке присутствуют два разных сайта FRT, а FLP присутствует в соответствующих концентрациях, кассета FRT будет продолжать вырезаться и вставляться между двумя сайтами FRT. Этот процесс будет продолжаться до тех пор, пока белки FLP не упадут ниже требуемых концентраций, в результате чего клетки внутри организма будут обладать разными генотипами.[9] Это было замечено от плодовых мушек до мышей и неизбирательно по отдельным хромосомам (соматическим и половым) или типам клеток (соматическим и зародышевым).[9][10]

Определение клеточных линий

Перед публикацией Димецкого и другие. (1998), рекомбиназа Cre была использована для картирования клеточных судеб нейрональных предшественников у мышей с использованием En2 промоутер.[11] Таким образом, авторы Dymecki и другие. (1998) предположили, что рекомбиназа FLP может использоваться аналогичным образом с такой же эффективностью, что и рекомбиназа Cre у мышей. Авторы создали две линии трансгенных мышей: линию слияния нейронов Wnt1 :: Flp и линию, которая обладала кассетой FRT, фланкирующей 18-й экзон tm1Cwr.[9] Авторы выбрали этот экзон для иссечения, потому что если он иссечен, это приводит к нулевому фенотипу. Авторы скрестили две линии и позволили потомству достичь взрослого состояния до того, как потомство было умерщвлено. Экстракцию РНК проводили на нейрональной, мышечной, кишечной ткани и ткани хвоста. ПЦР с обратной транскрипцией и северный блоттинг подтвердили удаление 18 экзона tm1Cwr обильно в мозговой ткани и умеренно в мышечной ткани (из-за Клетки Scwhann внутри мышцы). Как и ожидалось, в других тканях иссечения не было. Авторы увидели равную, если не лучшую, эффективность рекомбиназы FLP в определении судьбы клеток, чем рекомбиназа Cre.

В Drosophila melanogaster (Фруктовая муха)

На сегодняшний день рекомбиназа Flp использовалась много раз в D. melanogaster. Сравнение рекомбиназы Flp и рекомбиназы Cre в D. melanogaster был опубликован Frickenhaus и другие. (2015)[12]. Авторы Frickenhaus и другие. (2015) преследовали двоякую цель: охарактеризовать и сравнить эффективность «нокаута» рекомбиназы Flp с «нокаутом» рекомбиназы Cre и нокдауна РНКи и выявить функцию Cabeza (caz), ортолог мух к FUS, в нейронах и мышечной ткани D. melanogaster. FUS был сильно замешан в боковой амиотрофический склероз (ALS) и лобно-височная деменция в людях[12] . Авторы использовали Elav-Gal4 / UAS-Flp или Cre система для экспрессии рекомбиназы специфически в нейронах и Mef2-Gal4 / UAS-Flp или система Cre, чтобы выразить это конкретно в мышцах.[12] Авторы приходят к выводу, что инструмент «нокаута» рекомбиназы Flp более эффективен, чем рекомбиназа РНКи и Cre, для нокаута специфических генов в определенных тканях или клеточных линиях из-за отсутствия утечки экспрессии, наблюдаемой как в протеине Cre и транскрипт РНКи. Кроме того, авторы стали свидетелями токсичности для белка Cre, которая не наблюдается у белка Flp.[12]

В Данио Рерио (Данио)

Эффективность системы рекомбиназы FLPe была оценена на рыбках данио Wong и другие. (2009).[13] Эмбрионы, которые были гемизиготными по FRT-фланкированному усиленному зеленому флуоресцентному белку (EGFP) ниже мышечного промотора, инъецировали белком FLPe. Без FLPe эти эмбрионы должны экспрессировать EGFP во всей мышечной ткани и при скрещивании с цепью дикого типа 50% полученного потомства также должны экспрессировать EGFP в мышечной ткани. Эмбрионы, которым инъецировали FLPe, имели значительно сниженную экспрессию EGFP в мышечной ткани, также наблюдался мозаицизм.[13] Когда эти эмбрионы достигли зрелого возраста, они были скрещены со штаммом дикого типа, и полученные кладки дали значительно меньшее потомство, которое экспрессировало EGFP в мышечной ткани (0-4%).[13] Эти результаты показывают, что FLPe высокоэффективен не только в соматических клетках, но и в зародышевой линии рыбок данио, а также

В растениях

Создание «фитосенсоров» или «часовых» в Arabidopsis thaliana и табак

Фитосенсоры - это генетически модифицированные растения, которые могут сообщать о наличии биотических или абиотических загрязнителей.[14] Очевидно, что производство этих инженерных растений имеет большие перспективы для сельского хозяйства и лабораторий. Однако создание подходящего репортерного вектора оказалось проблематичным. СНГ-регуляторные элементы играют важную роль в активации транскрипции генов у растений, и многие из них еще недостаточно изучены. Многие фитосенсоры либо недостаточно экспрессируют свои репортерные гены, либо сообщают о ложноположительных результатах из-за синтетических промоторов.[14] Авторы Рао и другие. (2010) использовали инструмент рекомбиназы FLP для производства высокоэффективных фитосенсоров. Авторы использовали промотор теплового шока для индукции продукции FLP, в то время как вектор, фланкированный FRT, отделял промотор 35S CaMV от гена бета-глюкуронидазы (GUS). Когда растения подвергались тепловому шоку, индукция FLP приводила к удалению вектора, фланкированного FRT, эффективно перемещая ген GUS непосредственно ниже промотора 35S CaMV. Активация GUS привела к тому, что листья растений изменили цвет с зеленого на синий; таким образом, фитосенсор эффективно сообщает о стрессе модельной системе![14]

С Cre-рекомбиназой

Производство экспрессирующей системы индуцибельной MiRNA (GRIM), готовой к работе

РНК-интерференция (РНКи) вызвала сдвиг парадигмы в экспрессии генов и потенциальные нокауты генов у эукариот. До создания системы экспрессии GRIM создание векторов РНКи было дорогостоящим и требовало много времени. Векторы были получены традиционным методом молекулярного клонирования методом копирования и вставки.[15] Гарвик-Коппенс и другие. (2011) разработали гораздо более эффективный метод производства векторов РНКи, в которых экспрессия РНКи может быть выбита с помощью Cre-рекомбиназы и подавлена ​​с помощью Flp-рекомбиназы. Новая система экспрессии GRIM позволяет намного быстрее генерировать экспрессионные векторы, содержащие конструкции искусственной РНКи.[15] Далее авторы показали, что их система экспрессии довольно эффективно работает в клетках эмбриональных почек человека (HEK), обычной иммортализованной клеточной линии человека в молекулярных исследованиях.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Чжу XD, Садовски П.Д. (сентябрь 1995 г.). «Зависимое от расщепления лигирование рекомбиназой FLP. Характеристика мутантного белка FLP с изменением каталитической аминокислоты». Журнал биологической химии. 270 (39): 23044–54. Дои:10.1074 / jbc.270.39.23044. PMID 7559444.
  2. ^ Шлейк Т., Боде Дж. (Ноябрь 1994 г.). «Использование мутировавших сайтов-мишеней распознавания FLP (FRT) для обмена кассетами экспрессии в определенных хромосомных локусах». Биохимия. 33 (43): 12746–51. Дои:10.1021 / bi00209a003. PMID 7947678.
  3. ^ Туран С., Кюле Дж., Шамбах А., Баум С., Боде Дж. (Сентябрь 2010 г.). «Мультиплексирование RMCE: универсальные расширения технологии обмена кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой». Журнал молекулярной биологии. 402 (1): 52–69. Дои:10.1016 / j.jmb.2010.07.015. PMID 20650281.
  4. ^ Рейнольдс AE, Мюррей AW, Szostak JW (октябрь 1987). «Роль генных продуктов размером 2 микрона в стабильном поддержании плазмиды 2 микрона Saccharomyces cerevisiae». Молекулярная и клеточная биология. 7 (10): 3566–73. Дои:10.1128 / mcb.7.10.3566. ЧВК 368010. PMID 3316982.
  5. ^ а б c Сенекофф Дж. Ф., Россмейсл П. Дж., Кокс М. М. (май 1988 г.). «Распознавание ДНК рекомбиназой FLP дрожжевой плазмиды 2 mu. Мутационный анализ сайта связывания FLP». Журнал молекулярной биологии. 201 (2): 405–21. Дои:10.1016/0022-2836(88)90147-7. PMID 3047402.
  6. ^ Туран С., Боде Дж. (Декабрь 2011 г.). «Сайт-специфичные рекомбиназы: от геномных модификаций на основе тегов и мишеней до модификаций на основе тегов и обмена». Журнал FASEB. 25 (12): 4088–107. Дои:10.1096 / fj.11-186940. PMID 21891781.
  7. ^ а б c d е ж Ma CH, Kwiatek A, Bolusani S, Voziyanov Y, Jayaram M (апрель 2007 г.). «Выявление скрытого каталитического вклада консервативного His / Trp-III в тирозиновые рекомбиназы: сборка нового активного сайта в рекомбиназе Flp, несущего аланин в этом положении». Журнал молекулярной биологии. 368 (1): 183–96. Дои:10.1016 / j.jmb.2007.02.022. ЧВК 2002523. PMID 17367810.
  8. ^ а б Бухгольц Ф., Ангранд П.О., Стюарт А.Ф. (июль 1998 г.). «Улучшение свойств рекомбиназы FLP за счет циклического мутагенеза». Природа Биотехнологии. 16 (7): 657–62. Дои:10.1038 / nbt0798-657. PMID 9661200. S2CID 21298037.
  9. ^ а б c Dymecki SM, Tomasiewicz H (сентябрь 1998 г.). «Использование Flp-рекомбиназы для характеристики экспансии нейральных предшественников, экспрессирующих Wnt1, у мышей». Биология развития. 201 (1): 57–65. Дои:10.1006 / dbio.1998.8971. PMID 9733573.
  10. ^ Голич М.М., Ронг Ю.С., Петерсен Р.Б., Линдквист С.Л., Голич К.Г. (сентябрь 1997 г.). «FLP-опосредованная мобилизация ДНК к определенным сайтам-мишеням в хромосомах дрозофилы». Исследования нуклеиновых кислот. 25 (18): 3665–71. Дои:10.1093 / nar / 25.18.3665. ЧВК 146935. PMID 9278488.
  11. ^ Зиник Д.Л., Мерсер Э.Х., Харрис Э., Андерсон Д.Д., Джойнер А.Л. (май 1998 г.). «Картирование судьбы сужения среднего и заднего мозга мышей с использованием системы сайт-специфической рекомбинации». Текущая биология. 8 (11): 665–8. Дои:10.1016 / S0960-9822 (98) 70255-6. PMID 9635195.
  12. ^ а б c d Frickenhaus M, Wagner M, Mallik M, Catinozzi M, Storkebaum E (март 2015 г.). «Высокоэффективная инактивация гена, специфичного для клеточного типа, выявляет ключевую функцию cabeza гомолога FUS Drosophila в нейронах». Научные отчеты. 5: 9107. Дои:10.1038 / srep09107. ЧВК 5390904. PMID 25772687.
  13. ^ а б c Wong AC, Draper BW, Van Eenennaam AL (апрель 2011 г.). «Функции FLPe в эмбрионах рыбок данио». Трансгенные исследования. 20 (2): 409–15. Дои:10.1007 / s11248-010-9410-9. ЧВК 3051101. PMID 20552273.
  14. ^ а б c Рао М.Р., Мун Х.С., Шенк TM, Беккер Д., Мазарей М., Стюарт К.Н. (13 сентября 2010 г.). «Рекомбинация FLP / FRT из дрожжей: применение кассетной схемы с двумя генами в качестве индуцибельной системы у растений». Датчики. 10 (9): 8526–35. Дои:10,3390 / с100908526. ЧВК 3231192. PMID 22163670.
  15. ^ а б Garwick-Coppens SE, Herman A, Harper SQ (ноябрь 2011 г.). «Создание постоянно индуцируемых экспрессионных векторов на основе miRNA с использованием сайт-специфичных рекомбиназ». BMC Biotechnology. 11: 107. Дои:10.1186/1472-6750-11-107. ЧВК 3252340. PMID 22087765.

внешняя ссылка