WikiDer > Cre рекомбиназа

Cre recombinase
Смотрите также: Cre-Lox рекомбинация
Cre рекомбиназа
CreRecImage (DNASUBSTRATE) .png
Структура фермента (димера) рекомбиназы Cre, связанного с его субстратной ДНК
Идентификаторы
ОрганизмЭнтеробактерии фаг P1
СимволCre
Entrez2777477
RefSeq (Prot)YP_006472.1
UniProtP06956
Прочие данные
Номер ЕС2.7.7.-
Хромосомагеном: 0-0 Мб

Cre рекомбиназа тирозин-рекомбиназа фермент полученный из Бактериофаг P1. Фермент использует топоизомераза I-подобный механизм для выполнения сайт-специфическая рекомбинация События. Фермент (38 кДа) входит в состав интегрировать семейство сайт-специфичных рекомбиназ, и известно, что они катализируют сайт-специфическая рекомбинация событие между двумя сайтами узнавания ДНК (Сайты LoxP). Этот сайт узнавания loxP из 34 пар оснований (п.н.) состоит из двух п.н. палиндромные последовательности которые фланкируют спейсерную область размером 8 пар оснований. Продукция Cre-опосредованная рекомбинация на сайтах loxP зависят от расположения и относительной ориентации сайтов loxP. Два отдельных вида ДНК, оба из которых содержат сайты loxP, могут подвергаться слиянию в результате рекомбинации, опосредованной Cre. Последовательности ДНК, обнаруженные между двумя сайтами loxP, называются "флоксированный". В этом случае продукты рекомбинации, опосредованной Cre, зависят от ориентации сайтов loxP. ДНК, обнаруженная между двумя сайтами loxP, ориентированными в одном направлении, будет вырезана как кольцевая петля ДНК, в то время как ДНК будет вставлена ​​между двумя сайтами loxP, расположенными в противоположных направлениях. ориентированный будет перевернут.[1] Фермент не требует дополнительных кофакторов (таких как АТФ) или вспомогательные белки для своей функции.[2]

Фермент играет важную роль в жизненном цикле Бактериофаг P1 таких как циклизация линейного генома и разрешение димерных хромосомы эта форма после Репликация ДНК.[3]

Cre-рекомбиназа - широко используемый инструмент в области молекулярная биология. Уникальная и специфическая система рекомбинации фермента используется для манипулирования генами и хромосомами в огромном диапазоне исследований, таких как ген нокаут или вбить исследования. Способность фермента эффективно работать в широком диапазоне клеточных сред (включая млекопитающих, растения, бактерии и дрожжи) позволяет Cre-Lox рекомбинация Система может использоваться в огромном количестве организмов, что делает ее особенно полезным инструментом в научных исследованиях.[4]

Открытие

Исследования, проведенные в 1981 году Штернбергом и Гамильтоном, продемонстрировали, что бактериофаг «P1» обладает уникальной системой сайт-специфической рекомбинации. EcoRI фрагменты Бактериофаг P1 геном были созданы и клонированный в лямбда-векторы. 6,5 КБ EcoRI Было обнаружено, что фрагмент (фрагмент 7) допускает эффективные события рекомбинации.[5] Было известно, что механизм этих событий рекомбинации уникален, поскольку они происходят в отсутствие бактериального RecA и RecBCD белки. Компоненты этой системы рекомбинации были выяснены с использованием делеции мутагенез исследования. Эти исследования показали, что и продукт гена P1, и сайт рекомбинации необходимы для того, чтобы произошла эффективная рекомбинация. Продукт гена P1 был назван Cre (cаусы повторнокомбинация), а сайт рекомбинации был назван loxP (вотместо пересечения (Икс) над, п1).[5] Белок Cre был очищен в 1983 году, и было обнаружено, что он составляет 35000 Да.[2] Никаких высокоэнергетических кофакторов, таких как АТФ или дополнительные белки необходимы для рекомбиназной активности очищенного белка.[2] Ранние исследования также продемонстрировали, что Cre связывается с неспецифическими последовательностями ДНК, имея при этом в 20 раз более высокую аффинность к последовательностям loxP и результаты раннего ДНК-след исследования также показали, что молекулы Cre связывают сайты loxP как димеры.[2]

Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Вид сбоку
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим, а карбоксильный домен - зеленым. (Вид сбоку)
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Голова на виду
Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим, а карбоксильный домен - зеленым. (Голова на виду)
Члены семейства тирозин-рекомбиназы[3]
S.cerevisiae Рекомбиназа flp
Бактериальная рекомбиназа XerC
Бактериальная рекомбиназа XerD
белок интегразы λ
Белок интегразы HP1

Структура

Cre-рекомбиназа состоит из 343 аминокислоты которые образуют два разных домена. В аминоконцевой домен включает остатки 20–129, и этот домен содержит 5 альфа спиральный сегменты связаны серией коротких петель. Спирали A и E участвуют в образовании тетрамера рекомбиназы с С-концевой областью спирали Е, которая, как известно, образует контакты с С-концевым доменом соседних субъединиц. Спирали B и D образуют прямые контакты с большой бороздкой ДНК loxP. Считается, что эти две спирали образуют три прямых контакта с основаниями ДНК в сайте loxP. В карбоксильный конец домен фермента состоит из аминокислот 132–341 и содержит активный сайт фермента. Общая структура этого домена имеет большое структурное сходство с каталитический домен других ферментов того же семейства, таких как интеграза λ и интеграза HP1. Этот домен имеет преимущественно спиральную структуру с 9 отдельными спиралями (F-N). Концевая спираль (N) выступает из основной части карбокси-домена, и считается, что эта спираль играет роль в опосредовании взаимодействий с другими субъединицами. Кристаллические структуры демонстрируют, что эта терминальная спираль N погружает свою гидрофобную поверхность в акцепторный карман соседней субъединицы Cre.[6]

Эффект двухдоменной структуры заключается в формировании C-образного зажима, который захватывает ДНК с противоположных сторон.[3]

Активный сайт

Мультяшная модель активного сайта Cre-рекомбиназы. Фермент связан со своим субстратом (ДНК).
На этой мультипликационной модели рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК), аминокислоты, участвующие в активном центре, показаны красным цветом и помечены. Это изображение создается после расщепления ДНК.

В активный сайт фермента Cre состоит из консервированных каталитическая триада остатки Arg 173, Его 289, Arg 292, а также консервированные нуклеофильный остатки Тюр 324 и Trp 315. В отличие от некоторых ферментов рекомбиназы, таких как рекомбиназа Flp, Cre не образует общий активный сайт между отдельными субъединицами, и все остатки, которые вносят вклад в активный сайт, находятся в одной субъединице. Следовательно, когда две молекулы Cre связываются в одном сайте loxP, присутствуют два активных сайта. Cre-опосредованная рекомбинация требует образования синапса, в котором два комплекса Cre-LoxP связываются с образованием того, что известно как тетрамер синапса, в котором присутствуют 4 различных активных сайта.[6] Тюр 324 действует как нуклеофил с образованием ковалентной 3’-фосфотирозиновой связи с ДНК-субстратом. В ножницы фосфат (фосфат, нацеленный на нуклеофильную атаку на сайт расщепления) координируется боковыми цепями 3 аминокислота остатки каталитическая триада (Arg 173, Его 289 & Trp 315). В индол азот из триптофан 315 также образует водородная связь к этому ножницеобразному фосфату. (n.b A Гистидин занимает этот сайт у других членов семейства тирозин-рекомбиназ и выполняет ту же функцию). Эта реакция расщепляет ДНК и освобождает 5’-гидроксильную группу. Этот процесс происходит в активном центре двух из четырех субъединиц рекомбиназы, присутствующих в тетрамере синапса. Если 5’-гидроксильные группы атакуют 3’-фосфотирозиновую связь, одна пара нитей ДНК обменивается с образованием Холлидей Джанкшн промежуточный.[3]

Приложения

Роль в бактериофаге P1

Cre-рекомбиназа играет важную роль в жизненный цикл из Бактериофаг P1. При инфицировании клетки система Cre-loxP используется для того, чтобы вызвать циркуляризацию ДНК P1. В дополнение к этому Cre также используется для разделения димерной лизогенной ДНК P1, которая образуется во время клеточного деления фага.[7]

Использование в исследованиях

Простота и надежность систем Cre-loxP позволили ученым использовать фермент Cre для манипулирования ДНК как in vivo, так и in vitro. Увидеть Рекомбинация Cre-Lox Больше подробностей. Фермент Cre может экспрессироваться во многих различных организмах, таких как растения, бактерии, млекопитающие, дрожжи. В 1992 году Cre был экспрессирован и обнаружен, что он функционирует в организме мыши-хозяина.[8][9] Промоутер областями можно манипулировать для обеспечения точного временного контроля экспрессии фермента Cre (например, химерного регулятора GLVP, чувствительного к RU486).[10] Поскольку фермент имеет специфический ДНК-субстрат размером 34 пн, геном организма должен быть 1018 п.н. в длину, чтобы, вероятно, иметь место сайт loxP. Поскольку геномы млекопитающих в среднем находятся в районе 3×109 bp очень мала вероятность найти эндогенный loxP сайт.[1] Чтобы Cre работал на чужом хосте, экзогенный Сайты loxP должны быть спроектированы. Это позволяет точно контролировать активность фермента Cre в тестовых организмах.

Независимо, Джо З. Цзянь является пионером в использовании системы Cre-loxP для нейробиологических исследований с целью манипулирования генами, зависящими от типа и региона клеток, в мозге взрослого человека, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и почти все нейроны в мозге взрослого человека находятся в постмитотическом состоянии. Цзянь и его коллеги продемонстрировали, что Cre-обусловленная рекомбинация может происходить в постмитотических пирамидных нейронах переднего мозга взрослых мышей.[11] Явная демонстрация его полезности в точном определении сложных отношений между конкретными клетками / цепями и поведением для исследования мозга,[12] способствовал тому, что NIH инициировал проект NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver для мышей в начале 2000 года.[13][14] На сегодняшний день в рамках проекта NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre создано несколько сотен линий мыши с драйверами Cre, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.

Улучшения

В последние годы рекомбиназа Cre была усовершенствована путем превращения ее в предпочтительную форму млекопитающих кодоны, удаление сообщенных загадочных сайты сращивания, измененный стоп-кодон, и уменьшил CpG контент для снижения риска эпигенетических заглушить в млекопитающие.[15] Также был идентифицирован ряд мутантов с повышенной точностью.[16]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ а б Надь А. (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома». Бытие. 26 (2): 99–109. Дои:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID 10686599.
  2. ^ а б c d Абремски К., Хесс Р. (февраль 1984 г.). «Сайт-специфическая рекомбинация бактериофага P1. Очистка и свойства белка рекомбиназы Cre». Журнал биологической химии. 259 (3): 1509–1514. PMID 6319400.
  3. ^ а б c d Ван Дайн Г.Д. (2001). «Структурный вид сайт-специфической рекомбинации cre-loxp». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул. 30: 87–104. Дои:10.1146 / annurev.biophys.30.1.87. PMID 11340053.
  4. ^ Эннифар Э., Мейер Дж. Э., Бухгольц Ф., Стюарт А.Ф., Suck D (сентябрь 2003 г.). «Кристаллическая структура синапса Cre-рекомбиназа-loxP дикого типа демонстрирует новую конформацию спейсера, предполагающую альтернативный механизм активации расщепления ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 31 (18): 5449–5460. Дои:10.1093 / нар / gkg732. ЧВК 203317. PMID 12954782.
  5. ^ а б Штернберг Н., Гамильтон Д. (август 1981 г.). "Сайт-специфическая рекомбинация бактериофага P1. I. Рекомбинация между сайтами loxP". Журнал молекулярной биологии. 150 (4): 467–486. Дои:10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID 6276557.
  6. ^ а б Гуо Ф., Гопаул Д. Н., ван Дайн Г. Д. (сентябрь 1997 г.). «Структура Cre-рекомбиназы в комплексе с ДНК в синапсе сайт-специфической рекомбинации». Природа. 389 (6646): 40–46. Bibcode:1997 Натур.389 ... 40G. Дои:10.1038/37925. PMID 9288963.
  7. ^ Шейх А.С., Садовски П.Д. (февраль 1997 г.). «Рекомбиназа Cre расщепляет сайт lox в транс». Журнал биологической химии. 272 (9): 5695–5702. Дои:10.1074 / jbc.272.9.5695. PMID 9038180.
  8. ^ Лаксо М., Зауэр Б., Мосинджер Б., Ли Э. Дж., Мэннинг Р. У., Ю Ш., Малдер К. Л., Вестфаль Г. (июль 1992 г.). «Нацеленная активация онкогенов посредством сайт-специфической рекомбинации у трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (14): 6232–6236. Bibcode:1992ПНАС ... 89.6232Л. Дои:10.1073 / pnas.89.14.6232. ЧВК 49474. PMID 1631115.
  9. ^ Orban PC, Chui D, Marth JD (август 1992 г.). «Тканевая и сайт-специфическая рекомбинация ДНК у трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (15): 6861–6865. Bibcode:1992 ПНАС ... 89.6861O. Дои:10.1073 / пнас.89.15.6861. ЧВК 49604. PMID 1495975.
  10. ^ Kyrkanides S, Miller JH, Bowers WJ, Federoff HJ (ноябрь 2003 г.). «Транскрипционная и посттрансляционная регуляция рекомбиназы Cre посредством RU486 как основа для усиленной индуцибельной системы экспрессии». Молекулярная терапия. 8 (5): 790–795. Дои:10.1016 / j.ymthe.2003.07.005. PMID 14599812.
  11. ^ Цзянь и др. (1996). «Нокаут гена, ограниченного субрегиональным и клеточным типом, в мозге мышей». Ячейка. 87 (7): 1317–26. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 81826-7. PMID 8980237.
  12. ^ Цзянь Дж. З. и др. (1996b). «Существенная роль синаптической пластичности, зависящей от рецептора CA1 NMDA гиппокампа в пространственной памяти». Ячейка. 87 (7): 1327–38. Дои:10.1016 / s0092-8674 (00) 81827-9. PMID 8980238.
  13. ^ План NIH для нейробиологии: сеть драйверов Cre. http://www.neuroscienceblueprint.nih.gov/factSheet/CreDriver.htm
  14. ^ Мозговой проект GENSAT, http://www.gensat.org/index.html
  15. ^ Шимшек Д.Р., Ким Дж., Хюбнер М.Р., Спергель Д.Д., Бухгольц Ф., Казанова Е., Стюарт А.Ф., Зеебург PH, Шпренгель Р. (январь 2002 г.). «Экспрессия рекомбиназы Cre с улучшенными кодонами (iCre) у мышей». Бытие. 32 (1): 19–26. Дои:10.1002 / ген.10023. PMID 11835670.
  16. ^ Ерошенко Н., Church GM (сентябрь 2013 г.). «Мутанты Cre-рекомбиназы с повышенной точностью». Nature Communications. 4: 2509. Bibcode:2013 НатКо ... 4.2509E. Дои:10.1038 / ncomms3509. ЧВК 3972015. PMID 24056590.

внешние ссылки