WikiDer > Анализ связывания фильтра
 | Эта статья поднимает множество проблем. Пожалуйста помоги Улучши это или обсудите эти вопросы на страница обсуждения. (Узнайте, как и когда удалить эти сообщения-шаблоны) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения)
|
В биохимия или же химия, один из способов узнать о взаимодействии двух молекул - определить константа привязки, которое представляет собой число, которое описывает соотношение несвязанных и связанных молекул. Эта информация показывает сродство между двумя молекулами и позволяет предсказывать связанное количество при любом наборе начальных условий.
Чтобы измерить константу связывания, необходимо найти способ измерить количество комплекса, образованного в диапазоне исходных концентраций. Этого можно достичь, «пометив» один из видов флуоресцентным, или, в данном случае, радиоактивный тег. ДНК «маркируется» добавлением радиоактивных фосфат происходит от аденозинтрифосфат.
А анализ связывания фильтра это простой способ быстро изучить множество образцов. Он измеряет родство между двумя молекулами (часто белком и ДНК) с помощью фильтр. Фильтр состоит из нитроцеллюлоза бумага, которая заряжена отрицательно. Поскольку большинство белков имеют чистый положительный заряд, нитроцеллюлозная бумага идеально подходит для иммобилизации белков. ДНК имеет отрицательный заряд из-за фосфатного остова и не будет «прилипать» к нитроцеллюлозе сама по себе, однако любая ДНК, связанная белком, будет прилипать. Точное количество ДНК, «прилипшей» к нитроцеллюлозе, определяется количественно путем измерения количества радиоактивности на фильтре с помощью сцинтилляционный счетчик.
Белок и ДНК смешиваются в серии микроцентрифужных пробирок, в которых количество ДНК поддерживается постоянным, но количество белка постепенно увеличивается. Этим образцам дают уравновеситься. После уравновешивания равный объем из каждой трубки впрыскивается на маленькие круглые нитроцеллюлозные фильтры, которые расположены на вакуумной пластине (плоской поверхности, на которой снизу создается вакуум для всасывания жидкости вниз). Весь белок будет прилипать, но только белок, связанный с ДНК, зарегистрируется в сцинтилляционный счетчик.
Теперь у вас будет число, которое описывает количество связанной ДНК для каждой используемой концентрации белка, эту информацию можно нанести на кривую связывания для определения константа привязки.
Этот анализ больше не используется широко, но он быстрый и простой и может дать много информации. Его можно использовать, например, для относительно детального анализа конкретного взаимодействия белок-ДНК.
Измерьте константу равновесия:
- Инкубируйте меченую ДНК с белком.
- Подождите, пока система достигнет равновесия.
- Смесь фильтруют через фильтрующий диск из нитроцеллюлозы. Белки связываются с нитроцеллюлозой, а ДНК - нет.
- Любая ДНК, которая задерживается на фильтре, существует, потому что она взаимодействует с белком.
- Просушите фильтры и посчитайте.
Измерьте отклонение:
- Возьмите фильтр с привязанным к нему комплексом ДНК-белок.
- Промойте фильтр буфером.
- Определите количество ДНК, оставшейся на фильтре после его промывки в течение определенного времени.
Другой способ измерения отклонения:
- Радиоактивно меченые ДНК и белок предварительно инкубировали вместе в высоких концентрациях.
- В момент времени 0 смесь разбавляли
- Аликвоты анализировали в разное время с использованием нитроцеллюлозных фильтров.