WikiDer > Мультифокальная плоскостная микроскопия

Multifocal plane microscopy
Схема мультифокального плоского микроскопа.

Мультифокальная плоскостная микроскопия (MUM) или же Многоплоскостная микроскопия или же Бипланная микроскопия это форма света микроскопия что позволяет отслеживать трехмерную динамику в живых клетках на высоких временных и Пространственное разрешение путем одновременной визуализации различных фокальных плоскостей внутри образца.[1][2][3][4] В этой методологии свет, собранный из образца с помощью скорректированного на бесконечность объектив делится на два пути.[5] На каждом пути разделенный свет фокусируется на детекторе, который размещается на определенном калиброванном расстоянии от линзы трубки. Таким образом, каждый детектор отображает отдельную плоскость в образце. Первая разработанная установка MUM была способна отображать две различные плоскости внутри образца. Тем не менее, установка может быть изменена для изображения более чем двух плоскостей путем дальнейшего разделения света на каждом световом пути и фокусировки его на детекторах, размещенных на определенных калиброванных расстояниях. Другой метод, называемый многофокусной микроскопией (MFM), использует дифракционную оптику Фурье для изображения до 25 фокальных плоскостей.[6][7] В настоящее время реализованы установки MUM, которые могут отображать до четырех различных плоскостей.[8][9]

Вступление

Флуоресцентная микроскопия живых клеток представляет собой важный инструмент в изучении случаев торговли людьми. Традиционная конструкция микроскопа хорошо приспособлена для изображения быстрой клеточной динамики в двух измерениях, то есть в плоскости фокуса. Однако клетки представляют собой трехмерные объекты, и пути внутриклеточного трафика обычно не ограничиваются одной фокальной плоскостью. Если динамика не ограничена одной фокальной плоскостью, обычная технология одноплоскостной микроскопии неадекватна для подробных исследований быстрой внутриклеточной динамики в трех измерениях. Классические подходы, основанные на изменении фокальной плоскости, часто неэффективны в таких ситуациях, поскольку фокусирующие устройства относительно медленны по сравнению со многими внутриклеточными динамиками. Кроме того, фокальная плоскость может часто находиться не в том месте и в неподходящее время, тем самым упуская важные аспекты динамических событий.

Выполнение

MUM может быть реализован в любом стандарте оптический микроскоп. Пример реализации в микроскопе Zeiss следующий.[10] Двойной видеоадаптер Zeiss сначала подключается к боковому порту микроскопа Zeiss Axiovert 200. Затем два сдвоенных видеоадаптера Zeiss соединяются путем присоединения каждого из них к выходным портам первого видеоадаптера Zeiss. К каждому конкатенированному видеоадаптеру высокое разрешение CCD камера крепится с помощью C-образного / проставочного кольца и адаптера для соединения камеры, изготовленного на заказ. Расстояние между выходным портом видеоадаптера и камерой разное для каждой камеры, что приводит к тому, что камеры отображают разные фокальные плоскости.

Стоит отметить, что есть много способов реализовать MUM. Упомянутая реализация предлагает несколько преимуществ, таких как гибкость, простота установки и обслуживания, а также возможность настройки для различных конфигураций. Кроме того, для ряда приложений важно иметь возможность получать изображения разных цветов в разных время выдержки. Например, чтобы визуализировать экзоцитоз в TIRFM, нужно очень быстрое приобретение. Однако для изображения флуоресцентно меченой стационарной органеллы в клетке необходимо низкое возбуждение, чтобы избежать фотообесцвечивания, и в результате получение изображения должно быть относительно медленным.[11] В этом отношении описанная выше реализация предлагает большую гибкость, поскольку для получения изображений по разным каналам можно использовать разные камеры.

3D визуализация в сверхвысоком разрешении и отслеживание отдельных молекул с помощью MUM

Сравнение глубины дискриминации MUM с традиционной одноплоскостной микроскопией.

Современные методы микроскопии вызвали значительный интерес к изучению клеточных процессов на уровне отдельных молекул. Эксперименты с одной молекулой преодолевают эффекты усреднения и, следовательно, предоставляют информацию, недоступную при использовании обычных массовых исследований. Однако трехмерная локализация и отслеживание отдельных молекул создает несколько проблем. Помимо того, можно ли получить изображения отдельной молекулы, когда она подвергается потенциально очень сложной трехмерной динамике, возникает вопрос, можно ли определить трехмерное местоположение отдельной молекулы и насколько точно это можно сделать.

Основным препятствием на пути к высокой точности оценки трехмерного местоположения является плохая дискриминация по глубине стандартного микроскопа.[12] Даже с высоким числовая апертура объективный, образ точечный источник в обычном микроскопе существенно не меняется, если точечный источник перемещается на несколько сотен нанометров от его положения фокуса. Это делает чрезвычайно трудным определение осевого положения точечного источника, то есть положения z, с помощью обычного микроскопа.

В более общем плане количественная микроскопия одиночных молекул для трехмерных образцов представляет собой одинаковую проблему, независимо от того, является ли приложение локализацией / отслеживанием или микроскопия сверхвысокого разрешения такие как PALM, STORM, FPALM, dSTORM для 3D-приложений, то есть для определения местоположения отдельной молекулы в трех измерениях.[13] MUM предлагает несколько преимуществ.[14] В MUM изображения точечного источника одновременно получаются на разных уровнях фокусировки. Эти изображения предоставляют дополнительную информацию, которую можно использовать для ограничения положения по оси z точечного источника. Эта ограничивающая информация в значительной степени решает проблему различения глубины вблизи фокуса.

Измерение трехмерной локализации обеспечивает количественную оценку того, насколько точно местоположение точечный источник можно определить. Небольшое числовое значение меры трехмерной локализации предполагает очень высокую точность определения местоположения, в то время как большое числовое значение меры трехмерной локализации подразумевает очень низкую точность определения местоположения. Для обычного микроскопа, когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса, например, z0 <= 250 нм, мера трехмерной локализации предсказывает очень низкую точность оценки положения z. Таким образом, в обычном микроскопе проблематично выполнять трехмерное отслеживание, когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса.

С другой стороны, для двухплоскостной установки MUM мера трехмерной локализации предсказывает неизменно лучшую точность, чем обычный микроскоп для диапазона значений z, особенно когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса. Непосредственным следствием этого результата является то, что местоположение точечного источника по оси Z может быть определено с относительно одинаковым уровнем точности для диапазона значений z, что является благоприятным для 3D. отслеживание одиночной частицы.

Многофокальная микроскопия с двойным объективом (dMUM)

Многофокальный микроскоп с двойным объективом (dMUM).

В приложениях для визуализации отдельных частиц количество фотонов, обнаруженных флуоресцентной меткой, играет решающую роль в количественном анализе полученных данных. В настоящее время эксперименты по отслеживанию частиц обычно проводятся либо на инвертированном, либо на вертикальном микроскопе, в котором одна линза объектива освещает образец, а также собирает от него сигнал флуоресценции. Обратите внимание, что хотя флуоресцентное излучение от образца происходит во всех направлениях (то есть над и под образцом), использование одной линзы объектива в этих конфигурациях микроскопа приводит к улавливанию света только с одной стороны образца. Даже если используется объектив с высокой числовой апертурой, не все фотоны, испускаемые с одной стороны образца, могут быть собраны из-за конечного угла сбора линзы объектива. Таким образом, даже при самых лучших условиях визуализации обычные микроскопы собирают только часть фотонов, испускаемых образцом.

Чтобы решить эту проблему, можно использовать конфигурацию микроскопа, в которой используются две противоположные линзы объектива, при этом один из объективов находится в перевернутом положении, а другой - в вертикальном положении. Эта конфигурация называется мультифокальной микроскопией с двумя объективами (dMUM).[15]

Рекомендации

  1. ^ Prabhat, P .; Ram, S .; Ward, E.S .; Обер, Р.Дж. (2004). «Одновременная визуализация различных фокальных плоскостей в флуоресцентной микроскопии для изучения динамики клеток в трехмерном пространстве». IEEE Transactions по NanoBioscience. 3 (4): 237–242. Дои:10.1109 / TNB.2004.837899. ЧВК 2761735. PMID 15631134.
  2. ^ Prabhat, P .; Ram, S .; Ward, E.S .; Обер, Р.Дж. (2006). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсвелл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.). «Одновременная визуализация нескольких фокальных плоскостей в флуоресцентной микроскопии для изучения динамики клеток в 3D». Труды SPIE. Трехмерная и многомерная микроскопия: получение и обработка изображений XIII. 6090: 115–121. Дои:10.1117/12.644343. S2CID 119772837.
  3. ^ Демельт, Лейф; Бастиаенс, Филипп И. Х. (2010). «Пространственная организация внутриклеточной коммуникации: выводы из визуализации». Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 11 (6): 440–452. Дои:10.1038 / nrm2903. PMID 20485292. S2CID 12262683.
  4. ^ Тахмасби, А .; Ram, S .; Chao, J .; Abraham, A.V .; Tang, F.W .; Ward, E.S .; Обер, Р.Дж. (2014). «Расчет расстояния между фокальными плоскостями для мультифокальной микроскопии». Оптика Экспресс. 22 (14): 16706–16721. Bibcode:2014OExpr..2216706T. Дои:10.1364 / OE.22.016706. ЧВК 4162350. PMID 25090489.
  5. ^ Badieirostami, M .; Лью, доктор медицины; Thompson, M.A .; Moerner, W.E. (2010). «Точность трехмерной локализации функции рассеяния точки двойной спирали в сравнении с астигматизмом и бипланом». Письма по прикладной физике. 97 (16): 161103. Bibcode:2010АпФЛ..97п1103Б. Дои:10.1063/1.3499652. ЧВК 2980550. PMID 21079725.
  6. ^ Абрахамссон, Сара; Чен, Джиджи; Хадж, Бассам; Сталлинга, Шорд; Кацов Александр Юрьевич; Вишневски, Ян; Мидзугути, Гаку; Соул, Пьер; Мюллер, Флориан (1 января 2012 г.). «Быстрая многоцветная трехмерная визуализация с использованием многофокусной микроскопии с коррекцией аберраций». Природные методы. 10 (1): 60–63. Дои:10.1038 / nmeth.2277. ЧВК 4161287. PMID 23223154.
  7. ^ Абрахамссон, Сара; Маккуилкен, Молли; Мехта, Шалин Б .; Верма, Амитабх; Ларш, Йоханнес; Илич, Роб; Хайнцманн, Райнер; Bargmann, Cornelia I .; Гладфельтер, Эми С. (1 января 2015 г.). «Мультифокусный поляризационный микроскоп (MF-PolScope) для получения трехмерных поляризационных изображений одновременно в 25 фокальных плоскостях». Оптика Экспресс. 23 (6): 7734–7754. Bibcode:2015OExpr..23.7734A. Дои:10.1364 / oe.23.007734. ЧВК 5802244. PMID 25837112.
  8. ^ Рам, Шрипад; Прабхат, Прашант; Чао, Джерри; Салли Уорд, E .; Обер, Раймунд Дж. (2008). «Высокоточное трехмерное отслеживание квантовых точек с помощью микроскопии в мультифокальной плоскости для исследования быстрой внутриклеточной динамики в живых клетках». Биофизический журнал. 95 (12): 6025–6043. Bibcode:2008BpJ .... 95.6025R. Дои:10.1529 / biophysj.108.140392. ЧВК 2599831. PMID 18835896.
  9. ^ Dalgarno, P.A .; Dalgarno, H. I.C .; Putoud, A .; Lambert, R .; Патерсон, Л .; Logan, D.C .; Тауэрс, Д. П .; Warburton, R.J .; Гринуэй, А. Х. (2010). «Многоплоскостная визуализация и трехмерное отслеживание частиц в нанометровом масштабе в биологической микроскопии» (PDF). Оптика Экспресс. 18 (2): 877–884. Bibcode:2010OExpr..18..877D. Дои:10.1364 / OE.18.000877. PMID 20173908. S2CID 7701295.
  10. ^ «МАМА - Ward Ober Lab». UT Юго-Западный. Получено 19 июля 2012.
  11. ^ Prabhat, P .; Gan, Z .; Chao, J .; Ram, S .; Vaccaro, C .; Гиббонс, S .; Обер, Р. Дж .; Уорд, Э. С. (2007). «Выявление путей внутриклеточного рециклинга, ведущих к экзоцитозу рецептора Fc, FcRn, с помощью микроскопии в мультифокальной плоскости». Труды Национальной академии наук. 104 (14): 5889–5894. Bibcode:2007ПНАС..104.5889П. Дои:10.1073 / pnas.0700337104. ЧВК 1851587. PMID 17384151.
  12. ^ Ram, S .; Ward, E.S .; Обер, Р.Дж. (2005). Nicolau, Dan V; Эндерлейн, Йорг; Лейф, Роберт С; Farkas, Daniel L; Рагхавачари, Рамеш (ред.). «Насколько точно можно локализовать одну молекулу в трех измерениях с помощью флуоресцентного микроскопа?». Труды SPIE. Визуализация, манипуляции и анализ биомолекул и клеток: основы и приложения III. 5699: 426–435. Дои:10.1117/12.587878. ЧВК 2864488. PMID 20448826.
  13. ^ "Биплан FPALM микроскоп сверхвысокого разрешения".
  14. ^ Рам, Шрипад; Чао, Джерри; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Салли; Обер, Раймунд Дж. (2007). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсуэлл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.). «Новый подход к определению трехмерного местоположения микроскопических объектов с приложениями для отслеживания трехмерных частиц». Труды SPIE. Трехмерная и многомерная микроскопия: получение и обработка изображений XIV. 6443: 6443–0C. Дои:10.1117/12.698763. S2CID 121283489.
  15. ^ Рам, Шрипад; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Салли; Обер, Раймунд Дж. (2009). «Повышенная точность локализации отдельных частиц с помощью микроскопии с двойным объективом в мультифокальной плоскости». Оптика Экспресс. 17 (8): 6881–6898. Bibcode:2009OExpr..17.6881R. Дои:10.1364 / OE.17.006881. ЧВК 2720637. PMID 19365515.

внешняя ссылка