WikiDer > Смежный мотив Protospacer

Protospacer adjacent motif

А прилегающий мотив протоспейсера (PAM) - это 2–6-базовая пара ДНК последовательность сразу после последовательности ДНК, на которую нацелен Cas9 нуклеаза в CRISPR бактериальный адаптивная иммунная система.[1] PAM является компонентом вторгающегося вируса или плазмиды, но не обнаруживается в геноме бактериального хозяина и, следовательно, не является компонентом бактериального CRISPR локус. Cas9 не сможет успешно связываться с целевой последовательностью ДНК или расщеплять ее, если за ней не следует последовательность PAM.[2][3][4][5] PAM является важным нацеливающим компонентом, который отличает бактериальную ДНК от чужой, предотвращая тем самым нацеливание и разрушение локуса CRISPR с помощью CRISPR-связанной нуклеазы.[6]

Распорки / протоспейсеры

В бактериальном геноме локусы CRISPR содержат «спейсеры» (вирусную ДНК, вставленную в локус CRISPR), которые в адаптивные иммунные системы II типа были созданы из вторгающихся вирусных или плазмидных ДНК (называемых «протоспейсерами»). При последующем вторжении связанный с CRISPR нуклеаза Такие как Cas9 прикрепляется к tracrRNA–crRNA комплекс, который ведет Cas9 к вторгающейся последовательности протоспейсеров. Но Cas9 не будет расщеплять последовательность протоспейсера, если нет соседней последовательности PAM. Спейсер в бактериальных локусах CRISPR не будет содержать последовательность PAM и, таким образом, не будет разрезан нуклеазой, но протоспейсер во вторгающемся вирусе или плазмиде будет содержать последовательность PAM и, таким образом, будет расщеплен нуклеазой Cas9.[4] В редактирование генома приложений, короткий олигонуклеотид, известный как направляющая РНК (gRNA) синтезируется для выполнения функции комплекса tracrRNA-crRNA по распознаванию генных последовательностей, имеющих последовательность PAM в 3'-конец, тем самым «направляя» нуклеазу к определенной последовательности, которую нуклеаза способна разрезать.[7][8]

Последовательности PAM

Канонический PAM - это последовательность 5'-NGG-3 ', где «N» - любое азотистое основание за которыми следуют два гуанин («G») азотистые основания.[9] Направляющие РНК могут транспортировать Cas9 к любому локусу в геноме для редактирования гена, но никакое редактирование не может происходить ни на каком сайте, кроме того, в котором Cas9 распознает PAM. Канонический PAM связан с нуклеазой Cas9 Streptococcus pyogenes (обозначенные SpCas9), тогда как различные PAM связаны с белками Cas9 бактерии Neisseria meningitidis, Treponema denticola, и Термофильный стрептококк.[10] 5'-NGA-3 'может быть высокоэффективным неканоническим PAM для клеток человека, но эффективность зависит от местоположения генома.[11] Были предприняты попытки создать Cas9 для распознавания различных PAM, чтобы улучшить способность CRISPR-Cas9 редактировать гены в любом желаемом месте генома.[12]

Cas9 из Francisella novicida распознает каноническую последовательность PAM 5'-NGG-3 ', но была разработана для распознавания 5'-YG-3' (где "Y" - пиримидин[13]), тем самым увеличивая диапазон возможных целей Cas9.[14] В Cpf1 нуклеаза Francisella novicida распознает PAM 5'-TTTN-3 '[15] или 5'-YTN-3 '.[16]

Помимо CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cpf1, несомненно, существует множество еще не открытых нуклеаз и PAM.[17]

CRISPR / Cas13a (ранее C2c2[18]) от бактерии Leptotrichia shahii представляет собой систему CRISPR, управляемую РНК, которая нацелена на последовательности РНК, а не ДНК. PAM не имеет отношения к CRISPR, нацеленному на РНК, хотя гуанин, фланкирующий мишень, отрицательно влияет на эффективность, и был назван «сайтом фланкирования протоспейсера» (PFS).[19]

GUIDE-Seq

Технология под названием GUIDE-Seq был разработан для анализа расщеплений вне мишени, вызванных таким редактированием генов.[20] Требование PAM может быть использовано для специфического воздействия на однонуклеотидные гетерозиготные мутации, не оказывая при этом аберрантных эффектов на аллели дикого типа.[21]

Смотрите также

внешняя ссылка

Рекомендации

  1. ^ Шах С.А., Эрдманн С., Мохика Ф.Дж., Гаррет Р.А. (2013). «Мотивы распознавания Protospacer: смешанная идентичность и функциональное разнообразие». РНК Биология. 10 (5): 891–899. Дои:10.4161 / rna.23764. ЧВК 3737346. PMID 23403393.
  2. ^ Мохика Ф.Дж., Диес-Вильясеньор С., Гарсиа-Мартинес Дж., Альмендрос С. (2009). «Последовательности коротких мотивов определяют мишени системы защиты CRISPR прокариот». Микробиология. 155 (Pt 3): 733–740. Дои:10.1099 / микрофон.0.023960-0. PMID 19246744.
  3. ^ Шах С.А., Эрдманн С., Мохика Ф.Дж., Гаррет Р.А. (2013). «Мотивы распознавания Protospacer: смешанная идентичность и функциональное разнообразие». РНК Биология. 10 (5): 891–899. Дои:10.4161 / rna.23764. ЧВК 3737346. PMID 23403393. Архивировано из оригинал на 2014-09-04.
  4. ^ а б Джинек М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Дудна Дж. А., Шарпантье Е. (2012). «Программируемая двойная РНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете». Наука. 337 (6096): 816–821. Дои:10.1126 / наука.1225829. ЧВК 6286148. PMID 22745249.
  5. ^ Штернберг Ш., Реддинг С., Джинек М., Грин Э. К., Дудна Дж. А. (2014). "Исследование ДНК с помощью CRISPR-управляемой РНК эндонуклеазы Cas9". Природа. 507 (7490): 62–67. Дои:10.1038 / природа13011. ЧВК 4106473. PMID 24476820.
  6. ^ Мали П., Эсвелт К.М., Черч Г.М. (2013). «Cas9 как универсальный инструмент инженерной биологии». Методы природы. 10 (10): 957–963. Дои:10.1038 / nmeth.2649. ЧВК 4051438. PMID 24076990.
  7. ^ Мали П., Ян Л., Эсвелт К.М., Аач Дж., Гуэль М., ДиКарло Дж. Э., Норвилл Дж. Э., Чёрч Дж. М. (2013). «РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью Cas9». Наука. 339 (6121): 823–826. Дои:10.1126 / science.1232033. ЧВК 3712628. PMID 23287722.
  8. ^ Конг Л., Ран Ф.А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н., Сюй П.Д., Ву Х, Цзян В., Марраффини Л.А., Чжан Ф. (2013). «Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR / Cas». Наука. 339 (6121): 819–823. Дои:10.1126 / наука.1231143. ЧВК 3795411. PMID 23287718.
  9. ^ Андерс С., Невоенер О., Дюрст А., Янек М. (2014). «Структурные основы распознавания PAM-зависимой целевой ДНК эндонуклеазой Cas9». Природа. 513 (7519): 569–573. Дои:10.1038 / природа13579. ЧВК 4176945. PMID 25079318.
  10. ^ Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж. Л., Моосбернер М., Яунг С. Дж., Чёрч Г. М. (2013). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов под управлением РНК». Методы природы. 10 (11): 1116–1123. Дои:10.1038 / nmeth.2681. ЧВК 3844869. PMID 24076762.
  11. ^ Чжан И, Гэ Икс, Ян Ф, Чжан Л., Чжэн Дж, Тан X, Цзинь З.Б., Цюй Дж, Гу Ф (2014). «Сравнение неканонических PAM для CRISPR / Cas9-опосредованного расщепления ДНК в клетках человека». Научные отчеты. 4: 5405. Дои:10.1038 / srep05405. ЧВК 4066725. PMID 24956376.
  12. ^ Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK (2015). «Сконструированные нуклеазы CRISPR-Cas9 с измененной специфичностью PAM». Природа. 523 (7561): 481–485. Дои:10.1038 / природа14592. ЧВК 4540238. PMID 26098369.
  13. ^ «Нуклеотидные коды, аминокислотные коды и генетические коды». KEGG: Киотская энциклопедия генов и геномов. 15 июля 2014 г.. Получено 2016-04-06.
  14. ^ Хирано Х, Гутенберг Дж. С., Хори Т., Абудайе О. О., Кимура М., Хсу П. Д., Накане Т., Иситани Р., Хатада И., Чжан Ф., Нисимасу Х., Нуреки О. «Структура и инженерия Francisella novicida Cas9». Клетка. 164 (5): 950–961. Дои:10.1016 / j.cell.2016.01.039. ЧВК 4899972. PMID 26875867.
  15. ^ Цетше Б., Гутенберг Дж. С., Абудайе О. О., Slaymaker И. М., Макарова К. С., Эсслецбихлер П., Фольц С. Е., Джунг Дж., Ван дер Ост Дж, Регев А., Кунин Е. В., Чжан Ф. (2015) «Cpf1 - это одиночная РНК-управляемая эндонуклеаза системы CRISPR-Cas класса 2». Клетка. 163 (3): 759–771. Дои:10.1016 / j.cell.2015.09.038. ЧВК 4638220. PMID 26422227.
  16. ^ Фонфара I, Рихтер Х, Братович М, Ле Рун А, Шарпантье Э (2016). «Связанный с CRISPR ДНК-расщепляющий фермент Cpf1 также обрабатывает предшественник РНК CRISPR». Природа. 532 (7600): 517–521. Дои:10.1038 / природа17945. PMID 27096362.
  17. ^ «Даже CRISPR». Экономист. ISSN 0013-0613. Получено 2016-05-27.
  18. ^ Шмаков С и др. (2017). «Разнообразие и эволюция систем CRISPR-Cas 2 класса». Nat. Rev. Microbiol. 15 (3): 169–182. Дои:10.1038 / nrmicro.2016.184. ЧВК 5851899. PMID 28111461.
  19. ^ Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander ES, Koonin EV, Zhang F (2016). «C2c2 - однокомпонентный программируемый РНК-управляемый эффектор CRISPR, нацеленный на РНК». Наука. 353 (6299): aaf5573. Дои:10.1126 / science.aaf5573. ЧВК 5127784. PMID 27256883.
  20. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (2015). "GUIDE-seq позволяет профилировать расщепление вне мишени ядрами CRISPR-Cas по всему геному". Природа Биотехнологии. 33 (2): 187–197. Дои:10.1038 / nbt.3117. ЧВК 4320685. PMID 25513782.
  21. ^ Ли И, Мендиратта С., Эрхардт К., Кашьяп Н., Уайт М.А., Блерис Л. (2016). «Использование ограничения CRISPR / Cas9 PAM для вмешательств по разрешению одиночных нуклеотидов». PLoS One. 11 (1): e0144970. Дои:10.1371 / journal.pone.0144970. ЧВК 4720446. PMID 26788852.