WikiDer > GUIDE-Seq

GUIDE-Seq

GUIDE-Seq (Общегеномная беспристрастная идентификация DSB с помощью секвенирования) - это метод молекулярной биологии, который позволяет беспристрастно in vitro обнаружение нецелевое редактирование генома события в ДНК вызванный CRISPR / Cas9 а также другие нуклеазы, управляемые РНК, в живых клетках.[1] Подобно LAM-PCR, он использует несколько ПЦР для амплификации представляющих интерес областей, которые содержат специфическую вставку, которая предпочтительно интегрируется в двухцепочечные разрывы. Поскольку генная терапия является новой областью, GUIDE-Seq завоевал популярность как дешевый метод для обнаружения нецелевых эффектов потенциальных терапевтических средств без необходимости секвенирования всего генома.[нужна цитата]

Принципы

Задуман для совместной работы с платформами секвенирования следующего поколения, такими как Секвенирование красителей IlluminaGUIDE-Seq основан на интеграции тупого двухцепочечного олигодезоксинуклеотида (dsODN), который фосфотиорирован по двум фосфатным связям на 5'-конце обеих цепей.[1] Кассета dsODN интегрируется в любой сайт генома, который содержит двухцепочечный разрыв (DSB).[1] Это означает, что наряду с целевыми и нецелевыми сайтами, которые могут существовать в результате активности нуклеазы, кассета dsODN также будет интегрироваться в любые ложные сайты в геноме, которые имеют DSB.[1] Это делает критически важным наличие условия только для dsODN, которое контролирует ошибочные и естественные DSB, и требуется для использования биоинформатического конвейера GUIDE-seq.[1]

После интеграции кассеты dsODN геномную ДНК (гДНК) экстрагируют из культуры клеток и с помощью ультразвуковой обработки разрезают на фрагменты размером 500 п.н. Полученная в результате срезанная гДНК подвергается репарации концов и лигированию адаптера. Отсюда ДНК, конкретно содержащая вставку dsODN, амплифицируется посредством двух раундов полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая протекает однонаправленным образом, начиная с праймеров, комплементарных dsODN. Этот процесс позволяет считывать соседние последовательности, как смысловые, так и антисмысловые цепи, фланкирующие вставку. Конечный продукт представляет собой набор ампликонов, описывающих распределение DSB, содержащий индексы для дифференциации образцов, адаптеры проточных кювет p5 и p7 Illumina и последовательности, фланкирующие кассету dsODN.[1]

GUIDE-Seq может обеспечить обнаружение редких DSB, которые возникают с частотой 0,1%, однако это может быть результатом ограничений секвенирование следующего поколения платформы. Чем большей глубины считывания может достичь прибор, тем лучше он может обнаруживать более редкие события.[1] Кроме того, GUIDE-Seq может обнаруживать сайты, не предсказанные "in silico" методами, которые часто предсказывают сайты на основе сходства последовательностей и процента несоответствия.[1] Были случаи, когда GUIDE-Seq не обнаруживал никаких нецелевых мишеней для определенных направляющих РНК, что позволяет предположить, что некоторые нуклеазы, управляемые РНК, могут не иметь связанных нецелевых мишеней.[1][2] GUIDE-Seq был использован, чтобы показать, что модифицированные варианты Cas9 могут иметь уменьшенные эффекты вне цели.[3]

Предостережения

Было показано, что GUIDE-Seq пропускает некоторые отклонения от цели по сравнению с методом DIGENOME-Seq секвенирования всего генома из-за характера его нацеливания.[4] Еще одно предостережение заключается в том, что GUIDE-Seq, по наблюдениям, генерирует несколько разные нецелевые сайты в зависимости от клеточной линии.[1] Это может быть связано с клеточными линиями, имеющими различное родительское генетическое происхождение, специфическими мутациями клеточной линии или, в случае некоторых бессмертных клеточных линий, таких как K562s, анеуплоидией. Это говорит о том, что исследователям будет уместно протестировать несколько клеточных линий для проверки эффективности и точности.[нужна цитата]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j Цай, Шенгдар Q .; Чжэн, Цзунли; Nguyen, Nhu T .; Либерс, Мэтью; Топкар, Вед В .; Тапар, Вишал; Вивекенс, Николас; Хайтер, Сид; Иафрате, А. Джон; Le, Long P .; Aryee, Martin J .; Джунг, Дж. Кейт (февраль 2015 г.). «GUIDE-seq позволяет профилировать геномное расщепление с помощью нуклеаз CRISPR-Cas». Природа Биотехнологии. 33 (2): 187–197. Дои:10.1038 / nbt.3117. ЧВК 4320685. PMID 25513782.
  2. ^ Акчакая, Пинар; Бобин, Мэгги Л .; Гуо, Джимми А .; Малагон-Лопес, Хосе; Клемент, Кенделл; Гарсия, Сара П .; Товарищи, Мик Д.; Porritt, Michelle J .; Ферт, Майк А .; Каррерас, Альба; Бакчега, Таня; Силигер, Фрэнк; Бьюрселл, Микаэль; Цай, Шенгдар Q .; Nguyen, Nhu T .; Нитч, Роберто; Mayr, Lorenz M .; Пинелло, Лука; Бохлули-Й, Мохаммад; Aryee, Martin J .; Мареска, Марчелло; Джунг, Дж. Кейт (12 сентября 2018 г.). «Редактирование CRISPR in vivo без обнаруживаемых мутаций вне мишени по всему геному». Природа. 561 (7723): 416–419. Bibcode:2018Натура.561..416A. Дои:10.1038 / s41586-018-0500-9. ЧВК 6194229. PMID 30209390.
  3. ^ Kleinstiver, Benjamin P .; Паттанаяк, Викрам; Prew, Michelle S .; Цай, Шенгдар Q .; Nguyen, Nhu T .; Чжэн, Цзунли; Джунг, Дж. Кейт (январь 2016 г.). «Высококачественные нуклеазы CRISPR – Cas9 без обнаруживаемых нецелевых эффектов по всему геному». Природа. 529 (7587): 490–495. Bibcode:2016Натура.529..490K. Дои:10.1038 / природа16526. ЧВК 4851738. PMID 26735016.
  4. ^ Ким, Даесик; Ким, Соджунг; Ким, Сонхён; Пак, Чонбин; Ким, Джин Су (март 2016 г.). «Общегеномные целевые специфичности нуклеаз CRISPR-Cas9, выявленные с помощью мультиплексного Digenome-seq». Геномные исследования. 26 (3): 406–415. Дои:10.1101 / гр.199588.115. ЧВК 4772022. PMID 26786045.