WikiDer > SDD-AGE

SDD-AGE
Пример полученного вестерн-блоттинга после электрофоретического разделения SDD-AGE, окрашивания специфическими антителами

SDD-AGE это сокращение от SЭми-Dувлекающий Dмоющее средство АГарос граммэль Eлектрофорез. Это метод обнаружения и характеристики больших белок полимеры которые стабильны в 2% SDS в комнатная температурав отличие от большинства крупных белковые комплексы. Этот метод очень полезен для изучения прионы и амилоиды, которые характеризуются образованием белковый полимеры.[1][2][3][4][5][6] Агароза используется для геля, поскольку устойчивые к SDS полимеры имеют большие размеры (в диапазоне 200-4000 + кДа) и не могут входить в обычные полиакриламидный гель, имеющий мелкие поры. С другой стороны, агароза имеет большие поры, что позволяет разделять полимеры.

Использование этого метода позволило исследователям понять, что по крайней мере некоторые типы прионных агрегатов существуют в двухуровневой структуре - белковые молекулы сгруппированы в полимеры, которые очень стабильны и выдерживают обработку 2% SDS при комнатной температуре, и агрегаты, которые представляют собой связки полимеров, которые диссоциируют в этих условиях.

Различия в размерах полимеров могут указывать на эффективность фрагментации полимера. in vivo.

История

Метод был создан в Молекулярная генетика лаборатории ВНИИ кардиологии и был опубликован в 2003 году Крындушкиным и соавт.[1] В исходном методе использовался Буферизация TAE система и включала модифицированную систему вакуумного блоттинга для переноса белков на мембрану (первоначально ПВДФ). Модифицированная система вакуумного блоттинга на самом деле представляет собой капиллярный перенос с помощью вакуума, поскольку вакуум помогает только жидкость, которая уже прошла через гель и мембрана для выхода из системы.

Вариации

Также использовались другие модификации, такие как описанная у Багрянцева и др.,[7] с использованием традиционного влажного переноса и системы буферизации TGB, а также других, использующих полусухой перенос или капиллярный перенос.[8]

DD-AGE, еще один вариант метода, в котором полностью используется денатурирующий условия - включая восстановители, такие как дитиотреитол (DTT) и тепловая денатурация при 95 ° C - подходит для анализа термостойких тел включения полиглутаминовые белки.[9]

Рекомендации

  1. ^ а б Крындушкин Д.С.; Александров И.М.; Тер-Аванесян МД; Кушниров В.В. (2003). «Агрегаты прионов [PSI +] дрожжей образованы небольшими полимерами Sup35, фрагментированными Hsp104». Журнал биологической химии. 278 (49): 49636–43. Дои:10.1074 / jbc.M307996200. PMID 14507919.
  2. ^ Сальникова А.Б .; Крындушкин Д.С.; Смирнов В.Н.; Кушниров В.В.; Тер-Аванесян МД (2005). «Нонсенс подавление в дрожжевых клетках, сверхпродуцирующих Sup35 (eRF3), вызвано его ненаследственными амилоидами». Журнал биологической химии. 280 (10): 8808–12. Дои:10.1074 / jbc.M410150200. PMID 15618222.
  3. ^ Meriin AB; Чжан Х; Александров И.М.; Сальникова А.Б .; Тер-Аванесян MD; Чернов Ю.О .; Шерман М.Ю. (2007). «Аппарат эндоцитоза участвует в агрегации белков с расширенными доменами полиглутамина». Журнал FASEB. 21 (8): 1915–25. Дои:10.1096 / fj.06-6878com. PMID 17341688.
  4. ^ Шкундина И.С.; Кушниров В.В.; Tuite MF; Тер-Аванесян МД (2006). «Роль N-концевых олигопептидных повторов прионного белка Sup35 дрожжей в размножении и передаче прионных вариантов». Генетика. 172 (2): 827–35. Дои:10.1534 / генетика.105.048660. ЧВК 1456247. PMID 16272413.
  5. ^ Александров И.М.; Вишневская А.Б .; Тер-Аванесян МД; Кушниров В.В. (2008). «Возникновение и распространение амилоидов на основе полиглутамина в дрожжах: остатки тирозина делают возможной фрагментацию полимера». Журнал биологической химии. 283 (22): 15185–92. Дои:10.1074 / jbc.M802071200. ЧВК 2397454. PMID 18381282.
  6. ^ Альберти С; Halfmann R; Король О; Капила А; Линдквист С (2009). «Систематический обзор выявляет прионы и освещает особенности последовательности прионогенных белков». Клетка. 137 (1): 146–58. Дои:10.1016 / j.cell.2009.02.044. ЧВК 2683788. PMID 19345193.
  7. ^ Багрянцев С.Н.; Кушниров В.В.; Либман SW (2006). «Анализ амилоидных агрегатов с помощью электрофореза в агарозном геле». Методы в энзимологии. 412: 33–48. Дои:10.1016 / S0076-6879 (06) 12003-0. ISBN 9780121828172. PMID 17046650.
  8. ^ Halfmann R; Линдквист С (2008). «Скрининг агрегации амилоида с помощью полуденатурирующего детергентно-агарозного гель-электрофореза». Журнал визуализированных экспериментов (17). Дои:10.3791/838. ЧВК 2723713. PMID 19066511.
  9. ^ Вебер JJ; Голла М; Guaitoli G; Wanichawan P; Hayer SN; Hauser S; Krahl AC; Nagel M; Samer S; Aronica E; Карлсон CR; Schöls L; Рис О; Gloeckner CJ; Нгуен HP; Хюбенер-Шмид Дж (2017). «Комбинаторный подход к идентификации сайтов расщепления кальпаина в белке болезни Мачадо-Джозефа атаксин-3». Мозг. 140(5): 1280-1299. Дои:10.1093 / мозг / awx039. PMID 28334907.