WikiDer > Протеомика дробовика

Shotgun proteomics

Протеомика дробовика относится к использованию восходящая протеомика методы выявления белки в сложных смесях с использованием комбинации высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрии.[1][2][3][4][5][6] Название происходит от секвенирование дробовика из ДНК который сам назван в честь быстро расширяющейся квазислучайной схемы срабатывания дробовик. Самый распространенный способ стрельбы из дробовика протеомика начинается с белков в смеси переварен и в результате пептиды разделяются жидкостной хроматографией. Тандемная масс-спектрометрия затем используется для идентификации пептидов.

Нацеленная протеомика с использованием SRM и сбор данных, не зависящий от данных методы часто считаются альтернативой протеомике дробовика в области восходящая протеомика. В то время как протеомика дробовика использует зависимый от данных выбор ионов-предшественников для генерации сканирования ионов фрагментов, вышеупомянутые методы используют детерминированный метод для получения сканирований ионов фрагментов.

История

Протеомика дробовика возникла из-за трудностей использования предыдущих технологий для разделения сложных смесей. В 1975 г. был проведен двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-СТРАНИЦА) была описана О’Фарреллом и Клозе с возможностью разделения сложных белковых смесей.[7][8] Развитие матричной лазерной десорбционной ионизации (МАЛДИ), ионизация электрораспылением (ESI), а поиск в базах данных продолжал расширять область протеомики. Однако эти методы все еще затрудняли идентификацию и разделение белков с низким содержанием, аберрантных белков и мембранных белков. Протеомика дробовика возникла как метод, который может разрешить даже эти белки.[5]

Преимущества

Протеомика дробовика позволяет глобальную идентификацию белков, а также возможность систематически профилировать динамические протеомы.[9] Это также позволяет избежать умеренной эффективности разделения и низкой масс-спектральной чувствительности, связанных с анализом неповрежденного белка.[1]

Недостатки

Фильтрация динамического исключения, которая часто используется в протеомике дробовика, максимизирует количество идентифицированных белков за счет случайной выборки.[10] Эта проблема может усугубляться недостаточной выборкой, присущей протеомике дробовика.[11]

ВЭЖХ Agilent 1200
Квадрупольный времяпролетный тандемный масс-спектрометр (Q-TOF)

Рабочий процесс

Выращивают клетки, содержащие желаемый белковый комплемент. Затем белки экстрагируются из смеси и расщепляются протеазой для получения смеси пептидов.[9] Затем смесь пептидов загружают непосредственно в микрокапиллярную колонку, и пептиды разделяют по гидрофобности и заряду. Как пептиды элюировать из колонки они ионизируются и разделяются м / з на первом этапе тандемная масс-спектрометрия. Выбранные ионы претерпевают диссоциация, вызванная столкновением или другой процесс, вызывающий фрагментацию. Заряженные фрагменты разделяются на втором этапе тандемной масс-спектрометрии.

«Отпечаток пальца» масс-спектра фрагментации каждого пептида используется для идентификации белка, из которого они получены, путем поиска в базе данных последовательностей с помощью коммерчески доступного программного обеспечения (например, ЗАПРОС или же ТАЛИСМАН).[9] Примерами баз данных последовательностей являются база данных Genpept или база данных PIR.[12] После поиска в базе данных каждое совпадение пептидного спектра (PSM) необходимо оценить на предмет достоверности.[13] Этот анализ позволяет исследователям профилировать различные биологические системы.[9]

Проблемы с идентификацией пептидов

Вырожденные пептиды (общие для двух или более белков в базе данных) могут затруднить идентификацию белка, к которому они принадлежат. Кроме того, некоторые образцы протеома позвоночных имеют большое количество паралоги. Наконец, альтернативный сплайсинг у высших эукариот может привести к множеству идентичных белковых подпоследовательностей.[1]

Практическое применение

После секвенирования генома человека следующим шагом будет проверка и функциональная аннотация всех предсказанных генов и их белковых продуктов.[4] Протеомика дробовика может быть использована для функциональной классификации или сравнительного анализа этих белковых продуктов. Его можно использовать в проектах, начиная от крупномасштабного целого протеома до сосредоточения внимания на одном семействе белков. Это может быть сделано в исследовательских лабораториях или коммерчески.

Масштабный анализ

Одним из примеров этого является исследование Washburn, Wolters, & Yates, в котором они использовали протеомику дробовика на протеоме Saccharomyces cerevisiae штамм вырос до середины логарифмической фазы. Они смогли обнаружить и идентифицировать 1484 белка, а также идентифицировать белки, редко встречающиеся в протеомном анализе, включая белки с низким содержанием, такие как факторы транскрипции и протеинкиназы. Они также смогли идентифицировать 131 белок с тремя или более предсказанными трансмембранные домены.[2]

Семейство белков

Vaisar et al. использует протеомику дробовика, чтобы вовлечь ингибирование протеазы и активацию комплемента в противовоспалительные свойства липопротеин высокой плотности.[14] В исследовании Lee et al., Более высокий уровень экспрессии hnRNP A2 / B1 и Hsp90 наблюдались в гепатоме человека HepG2 клеток, чем в клетках дикого типа. Это привело к поиску сообщенных функциональных ролей, опосредованных совместно обоими этими многофункциональными клеточными шаперонами.[15]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Алвес, П; Арнольд, RJ; Новотный, М.В. Radivojac, P; Рейли, JP; Тан, H (2007). «Улучшение вывода белков из протеомики дробовика с использованием детектируемости пептидов». Тихоокеанский симпозиум по биокомпьютингу: 409–20. PMID 17990506.
  2. ^ а б Washburn MP, Wolters D, Yates JR (2001). «Крупномасштабный анализ протеома дрожжей с помощью технологии многомерной идентификации белков». Nat. Биотехнология. 19 (3): 242–247. Дои:10.1038/85686. PMID 11231557. S2CID 16796135.
  3. ^ Wolters DA, Washburn MP, Yates JR (2001). «Автоматизированная технология многомерной идентификации белков для протеомики дробовика». Анальный. Chem. 73 (23): 5683–5690. Дои:10.1021 / ac010617e. PMID 11774908.
  4. ^ а б Ху Л, Е М, Цзян Х, Фэн С., Цзоу Х (2007). «Достижения в дефисных аналитических методах для анализа протеома дробовика и пептидома - обзор». Анальный. Чим. Acta. 598 (2): 193–204. Дои:10.1016 / j.aca.2007.07.046. PMID 17719892.
  5. ^ а б Fournier ML, Gilmore JM, Martin-Brown SA, Washburn MP (2007). «Протеомика дробовика на основе многомерных разделений». Chem. Rev. 107 (8): 3654–86. Дои:10.1021 / cr068279a. PMID 17649983.
  6. ^ Несвижский А.И. (2007). «Идентификация белков с помощью тандемной масс-спектрометрии и поиска в базе данных последовательностей». Анализ данных масс-спектрометрии в протеомике. Методы Мол. Биол. 367. С. 87–119. Дои:10.1385/1-59745-275-0:87. ISBN 978-1-59745-275-5. PMID 17185772.
  7. ^ О'Фаррелл, PH (25 мая 1975 г.). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения». Журнал биологической химии. 250 (10): 4007–21. ЧВК 2874754. PMID 236308.
  8. ^ Клозе, Дж (1975). «Картирование белков путем комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих». Humangenetik. 26 (3): 231–43. Дои:10.1007 / bf00281458 (неактивно 11.11.2020). PMID 1093965.CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2020 г. (связь)
  9. ^ а б c d Ву CC, Маккосс MJ (2002). «Протеомика дробовика: инструменты для анализа сложных биологических систем». Современное мнение о молекулярной терапии. 4 (3): 242–50. PMID 12139310.
  10. ^ Чжан Б., VerBerkmoes NC, Langston MA, Uberbacher E, Hettich RL, Samatova NF (2006). «Обнаружение дифференциальной и коррелированной экспрессии белков в безметочной протеомике дробовика». J Proteome Res. 5 (11): 2909–2918. Дои:10.1021 / pr0600273. PMID 17081042. S2CID 22254554.
  11. ^ Толмачев А.В., Монро М.Э., Пурвин С.О., Мур Р.Дж., Джайтли Н., Адкинс Дж. Н., Андерсон Г. А., Смит Р. Д. (2008). «Характеристика стратегий для получения уверенной идентификации в восходящих протеомных измерениях с использованием гибридных инструментов FT MS». Анальный. Chem. 80 (22): 8514–8525. Дои:10.1021 / ac801376g. ЧВК 2692492. PMID 18855412.
  12. ^ Eng, Джимми К .; Маккормак, Эшли Л .; Йейтс, Джон Р. (1 ноября 1994 г.). «Подход к корреляции тандемных масс-спектральных данных пептидов с аминокислотными последовательностями в базе данных белков». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 5 (11): 976–989. Дои:10.1016/1044-0305(94)80016-2. PMID 24226387. S2CID 18413192.
  13. ^ Cerqueira, Fabio R; Феррейра, Рикардо С; Oliveira, Alcione P; Гомеш, Андрей П; Рамос, Умберто Джо; Грабер, Армин; Баумгартнер, Кристиан (1 января 2012 г.). «MUMAL: многомерный анализ в протеомике дробовика с использованием методов машинного обучения». BMC Genomics. 13: S4. Дои:10.1186 / 1471-2164-13-S5-S4. ЧВК 3477001. PMID 23095859.
  14. ^ Вайсар, Томас; Пеннатур, Субраманиам; Грин, Пэтти С .; Gharib, Sina A .; Hoofnagle, Andrew N .; Cheung, Marian C .; Бьюн, Джеман; Вулетик, Симона; Кассим, Шон; Сингх, Прагья; Чеа, Хелен; Кнопп, Роберт Х .; Брунзель, Джон; Гири, Рэндольф; Чайт, Алан; Чжао, Сюэ-Цяо; Элкон, Кейт; Марковина, Сантика; Ридкер, Пол; Орам, Джон Ф .; Хайнеке, Джей В. (1 марта 2007 г.). «Протеомика дробовика предполагает ингибирование протеаз и активацию комплемента в противовоспалительных свойствах ЛПВП». Журнал клинических исследований. 117 (3): 746–756. Дои:10.1172 / JCI26206. ЧВК 1804352. PMID 17332893.
  15. ^ Ли, Чи-Лей; Сяо, Хэ-Сюань; Линь, Чиа-Вэй; Ву, Су-Пей; Хуанг, Шиуань-И; У, Чи-Юэ; Ван, Эндрю Х.-Дж .; Кху, Кай-Хой (1 декабря 2003 г.). «Стратегический подход протеомики дробовика для эффективного построения карты экспрессии целевых семейств белков в клеточных линиях гепатомы». Протеомика. 3 (12): 2472–2486. Дои:10.1002 / pmic.200300586. PMID 14673797. S2CID 24518852.

дальнейшее чтение

внешняя ссылка