WikiDer > Количественная оценка без этикеток

Label-free quantification

Количественная оценка без этикеток это метод в масс-спектрометрии цель которого - определить относительное количество белки через два или более биологический образцы. В отличие от других методов для количественное определение белка, количественный анализ без этикеток не использует стабильный изотоп содержащее соединение для химического связывания с белком и, таким образом, метки.[1][2]

Выполнение

Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника или на спектральный счет.Первый метод полезен при применении к масс-спектрам высокой точности, например, полученным с использованием нового поколения время полета (ToF), ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR) или Орбитальная ловушка масс-анализаторы. Мощность высокого разрешения облегчает выделение пептидных сигналов на МС.1 В отличие от этого, при спектральном подсчете просто подсчитывается количество спектров, идентифицированных для данного пептида в различных биологических образцах, а затем интегрируются результаты для всех измеренных пептидов белка (белков), которые оцениваются количественно.

Вычислительная структура подхода без меток включает в себя обнаружение пептидов, сопоставление соответствующих пептидов по множеству данных ЖХ-МС, выбор дискриминационных пептидов.[3][4]

Спектрометрия экспрессии интактного белка (IPEx) - это метод количественной оценки без использования меток в масс-спектрометрии, разрабатываемый группой аналитической химии в США. Управление по контролю за продуктами и лекарствами Центр безопасности пищевых продуктов и прикладного питания и другие места. Интактные белки анализируются с помощью ЖХМС инструмент, обычно квадруполь время полета в режиме профиля, а полный профиль белка определяется и количественно определяется с использованием программное обеспечение для обработки данных. Первые результаты очень обнадеживают. В одном исследовании две группы повторений лечения из образцов млекопитающих (разные организмы с аналогичной историей лечения, но не технические повторения) показывают десятки биомаркеров белка с низким CV, что позволяет предположить, что IPEx является жизнеспособной технологией для изучения экспрессии белка.[5]

Обнаружение пептидов

Обычно пептидные сигналы обнаруживаются на уровне MS1 и отличаются от химического шума по их характерной изотопной структуре. Эти закономерности затем отслеживаются по измерению времени удерживания и используются для восстановления хроматографического профиля элюирования массы моноизотопного пептида. Затем интегрируют общий ионный ток пептидного сигнала и используют в качестве количественного измерения исходной концентрации пептида. Для каждого детектированного пептида сначала обнаруживаются все изотопные пики, а затем определяется состояние заряда.

Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника и имеет проблемы из-за помех изоляции: в высокопроизводительных исследованиях идентичность измеряемого иона-предшественника пептида легко может быть совершенно другим пептидом с аналогичным соотношением m / z и который элюируется во временном интервале, совпадающем с временным интервалом первого пептида. Спектральный подсчет имеет проблемы из-за того, что пептиды идентифицированы, что делает необходимым выполнение дополнительного сканирования MS / MS, которое требует времени и, следовательно, снижает разрешающую способность эксперимента .

Соответствующие пептиды

В отличие от дифференциальной маркировки, каждый биологический образец необходимо измерять отдельно в эксперименте без маркировки. Затем извлеченные пептидные сигналы сопоставляются с несколькими или несколькими измерениями ЖХ-МС с использованием их координат по измерениям массы-заряда и времени удерживания. Данные, полученные с помощью высокоточных приборов, значительно облегчают этот процесс и повышают уверенность в сопоставлении правильных сигналов пептидов во время прогонов.

Очевидно, что дифференциальная обработка биологических образцов требует наличия стандарта, который можно использовать для корректировки результатов. Для этой цели можно использовать пептиды, уровень экспрессии которых не ожидается в различных биологических образцах. Однако не все пептиды хорошо ионизируются, поэтому выбор кандидатов следует делать после первоначального исследования, которое должно охарактеризовать только содержание белка в биологических образцах, которые будут исследованы.

Выбор дискриминационных пептидов

Наконец, сложные методы нормализации используются для удаления систематических артефактов в значениях интенсивности пептидов между измерениями ЖХ-МС. Затем дискриминационные пептиды идентифицируются путем выбора пептидов, нормализованная интенсивность которых различна (например, значение p <0,05) среди нескольких групп образцов.

Кроме того, более новые гибридные масс-спектрометры, такие как LTQ OrbiTrap, предлагают возможность получения идентификации пептидов MS / MS параллельно с измерением пептидов с высокой точностью измерения массы на уровне MS1. Это создает вычислительную проблему для обработки и интеграции этих двух источников информации и привело к разработке новых многообещающих стратегий количественной оценки.

Рекомендации

  1. ^ Баншефф М., Ширле М., Свитмен Дж., Рик Дж., Кустер Б. (октябрь 2007 г.). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: критический обзор». Аналитическая и биоаналитическая химия. 389 (4): 1017–31. Дои:10.1007 / s00216-007-1486-6. PMID 17668192.
  2. ^ Asara JM, Christofk HR, Freimark LM, Cantley LC (март 2008 г.). «Метод количественной оценки без меток с помощью MS / MS TIC по сравнению с SILAC и спектральным подсчетом на протеомном экране». Протеомика. 8 (5): 994–9. Дои:10.1002 / pmic.200700426. PMID 18324724.
  3. ^ Бриджес С.М., Маги ГБ, Ван Н., Уильямс В.П., Берджесс С.К., Нандури Б. (2007). «ProtQuant: инструмент для количественной оценки протеомических данных MudPIT без этикеток». BMC Bioinformatics. 8 Приложение 7: S24. Дои:10.1186 / 1471-2105-8-S7-S24. ЧВК 2099493. PMID 18047724.
  4. ^ Лукас Н. Мюллер; и другие. (2008). «Оценка программных решений для анализа данных количественной протеомики на основе масс-спектрометрии». Журнал протеомных исследований. 7 (1): 51–61. CiteSeerX 10.1.1.336.4416. Дои:10.1021 / pr700758r. PMID 18173218.
  5. ^ Шолль, П.Ф., Стратегия ЖХ / МС с интактным белком для разработки биомаркеров сыворотки: биомаркеры реакции печени на химиопрофилактическое лечение тритерпеноидом CDDO-Im, Абстрактный, TOA 8:35 Конференция ASMS, 2007.