WikiDer > Просвечивающая электронная криомикроскопия

Transmission electron cryomicroscopy
CryoTEM изображение GroEL приостановлено в аморфный лед в 50000× увеличение
Структура Спиртовая оксидаза из Pichia pastoris компании CryoTEM

Просвечивающая электронная криомикроскопия (CryoTEM), широко известный как крио-ЭМ, это форма криогенная электронная микроскопия, а точнее тип просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), где образец исследуется при криогенный температуры (обычно жидкий азот температуры).[1] Крио-ЭМ набирает популярность в структурная биология.[2]

Полезность просвечивающей электронной криомикроскопии проистекает из того факта, что она позволяет наблюдать образцы, которые не были окрашены или не фиксированы каким-либо образом, показывая их в естественной среде. Это в отличие от Рентгеновская кристаллография, что требует кристаллизации образца, что может быть затруднительно, и помещения его в нефизиологическую среду, что иногда может привести к функционально несущественным конформационным изменениям.

Достижения в технология детектора электронов, в частности, DDE (прямые электронные детекторы), а также более мощные программные алгоритмы визуализации позволили определять макромолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [3]Изображенные макромолекулы включают вирусы, рибосомы, митохондрии, ионные каналы, и фермент комплексы. Начиная с 2018 года крио-ЭМ можно применять для конструкций размером от гемоглобин (64 кДа)[4] и с разрешением до 1,8 Å.[5] В 2019 году криоЭМ-структуры составляли 2,5% структур, депонированных в Банк данных белков,[6], и это число продолжает расти.[7] Применение крио-ЭМ - криоэлектронная томография (cryo-ET), где 3D-реконструкция образца создается из наклонных 2D-изображений.

Разработка

Первоначальное обоснование CryoTEM было средством борьбы радиационное повреждение для биологических образцов. Количество излучения, необходимое для получения изображения образца в электронный микроскоп достаточно высока, чтобы быть потенциальным источником повреждения образцов для хрупких конструкций. В дополнение высокий вакуум Требование к колонке электронного микроскопа делает среду для образца довольно жесткой.

Проблема вакуума была частично решена введением отрицательные пятна но даже с отрицательными пятнами биологические образцы подвержены структурному разрушению при обезвоживание образца. Возможность погружения образцов во лед при температуре ниже температуры сублимации была рассмотрена на раннем этапе, но вода имеет тенденцию образовывать кристаллическую решетку более низкой плотности при замерзании, и это может разрушить структуру всего, что в ней заключено.

В начале 1980-х годов несколько групп, изучающих физику твердого тела, пытались создать стекловидный лед другими способами, такими как замораживание под высоким давлением или мгновенное замораживание. В основополагающей статье 1984 года группа во главе с Жак Дюбоше на Европейская лаборатория молекулярной биологии показал изображения аденовирус погруженный в застеклованный слой воды.[8] Обычно считается, что эта бумага указывает на происхождение крио-ЭМ, и этот метод был разработан до такой степени, что стал обычным явлением во многих лабораториях по всему миру.

Энергия электронов, используемых для визуализации (80–300 кВ), достаточно высока, чтобы ковалентные связи можно сломать. Если образцы для визуализации уязвимы для радиационного повреждения, необходимо ограничить электронное облучение, используемое для получения изображения. Эти низкие экспозиции требуют, чтобы изображения тысяч или даже миллионов идентичных замороженных молекул были выбраны, выровнены и усреднены для получения карт высокого разрешения с использованием специализированного программного обеспечения. Значительное улучшение конструктивных характеристик было достигнуто в 2012 году за счет внедрения прямые детекторы электронов и лучшие вычислительные алгоритмы.[1][2]

В 2015 г. Бриджит Каррагер и ее коллеги из Национального ресурса по автоматизированной молекулярной микроскопии Скриппса использовали методы, которые она и Клинт Поттер разработан для определения первой крио-ЭМ-структуры с разрешением менее 3 Å, что делает CryoTEM инструментом, сравнимым с традиционными методами рентгеновской кристаллографии и потенциально превосходящим их.[9][10] С тех пор было достигнуто более высокое разрешение, в том числе структура бактериального фермента 2,2 Å. β-галактозидаза в 2015 году[11] и структура 1,8 Å глутаматдегидрогеназа в 2016 году.[12] Крио-ЭМ также использовалась для определения структуры различных вирусов, включая Вирус Зика,[13] и был применен к крупным комплексам, таким как сплайсосома.[14] В 2017 г. Нобелевская премия по химии был присужден совместно Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон, «За разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворах с высоким разрешением».[15]

Биологические образцы

Тонкая пленка

Биологический материал наносится на сетку электронной микроскопии и хранится в замороженно-гидратированное состояние быстрым замораживанием, обычно в жидкости этан возле жидкий азот температура. Поддерживая образцы при температуре жидкого азота или ниже, их можно помещать ввакуум из электронный микроскоп столбец. Большинство биологических образцов чрезвычайно радиочувствительный, поэтому они должны быть получены с помощью методов с малой дозой (полезно, низкая температура трансмиссионной электронной криомикроскопии обеспечивает дополнительный фактор защиты от радиационного повреждения).

Следовательно, изображения чрезвычайно шумный. Для некоторых биологических систем возможно усреднение изображений для увеличения отношения сигнал / шум и получения информации с высоким разрешением об образце с использованием метода, известного как анализ отдельных частиц. Этот подход в целом требует, чтобы усредняемые вещи были идентичными, хотя теперь можно изучить некоторую ограниченную конформационную гетерогенность (например, рибосома). Трехмерные реконструкции из изображений CryoTEM белковых комплексов и вирусы были решены с субнанометровым или почти атомным разрешением, что позволило по-новому взглянуть на структуру и биологию этих больших сборок.

Анализ упорядоченных массивов белков, таких как 2-D кристаллы из трансмембранные белки или же спиральный массивов белков, также позволяет выполнять своего рода усреднение, которое может предоставить информацию об образце с высоким разрешением. Эта техника называется электронная кристаллография.

Стекловидные секции

Метод тонких пленок ограничен тонкими образцами (обычно <500 нм), потому что электроны не могут пересекать более толстые образцы без многократного рассеяния. Более толстые образцы можно остекловать путем глубокой заморозки (криофиксация) в этане (толщиной до десятков мкм) или чаще замораживание под высоким давлением (до сотен мкм). Затем их можно разрезать на тонкие срезы (толщиной от 40 до 200 нм) алмазным ножом в криоультрамикротом при температуре ниже −135 ° C (температура расстекловывания). Срезы собираются на сетке электронного микроскопа и отображаются таким же образом, как и образец, остеклованный в тонкой пленке. Этот метод называется просвечивающей электронной криомикроскопией стекловидных срезов (CEMOVIS) или просвечивающей электронной криомикроскопией замороженных гидратированных срезов.

Образцы материалов

Помимо возможности визуализации застеклованных биологических образцов, CryoTEM также может использоваться для визуализации образцов материалов, которые слишком летучие в вакууме для получения изображений с помощью стандартной электронной микроскопии при комнатной температуре. Например, застеклованные участки поверхности раздела жидкость-твердое тело могут быть извлечены для анализа с помощью CryoTEM,[16] а сера, которая склонна к сублимации в вакууме электронных микроскопов, может быть стабилизирована и отображена в CryoTEM.[17]

Методы

В CryoTEM можно использовать различные методы.[18] Популярные техники включают:

  1. Электронная кристаллография
    1. Анализ двумерных кристаллов
    2. Анализ спиральных нитей или трубок
    3. Дифракция электронов на микрокристаллах (MicroED)[19][20][21][22]
  2. Анализ отдельных частиц (СПА)
    1. CryoTEM с временным разрешением[23][24][25]
  3. Электронная криотомография (криоЭТ)

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Kühlbrandt W (август 2014 г.). «Крио-ЭМ вступает в новую эру». eLife. 3: e03678. Дои:10.7554 / elife.03678. ЧВК 4131193. PMID 25122623.
  2. ^ а б Callaway E (сентябрь 2015 г.). «Революция не будет кристаллизоваться: новый метод пронизывает структурную биологию». Природа. 525 (7568): 172–4. Bibcode:2015Натура. 525..172C. Дои:10.1038 / 525172a. PMID 26354465.
  3. ^ Мурата К., Вольф М. (февраль 2018 г.). «Криоэлектронная микроскопия для структурного анализа динамических биологических макромолекул». Biochimica et Biophysica Acta. Дои:10.1016 / j.bbagen.2017.07.020.
  4. ^ Хошоуей М., Раджайня М., Баумейстер В., Данев Р. (июнь 2017 г.). «Крио-ЭМ структура гемоглобина при 3,2 Å, определенная с помощью фазовой пластины Вольта». Nature Communications. 8: 16099. Дои:10.1038 / ncomms16099. ЧВК 5497076. PMID 28665412.
  5. ^ Мерк А., Бартесаги А., Банерджи С., Фальконьери В., Рао П., Дэвис М. И., Прагани Р., Боксер М. Б., Эрл Л. А., Милн Д. Л., Субраманиам С. (июнь 2016 г.). «Преодоление барьеров в разрешении крио-ЭМ для облегчения открытия лекарств». Клетка. 165 (7): 1698–1707. Дои:10.1016 / j.cell.2016.05.040. ЧВК 4931924. PMID 27238019.
  6. ^ «Распределение данных PDB по экспериментальным методам и типам молекул». www.rcsb.org. Получено 2019-12-03.
  7. ^ "Статистика PDB: рост структур из экспериментов 3DEM, выпущенных за год". www.rcsb.org. Получено 2018-12-22.
  8. ^ Адриан М, Дюбоше Дж, Лепо Дж, Макдауэлл AW (1984). «Криоэлектронная микроскопия вирусов». Природа. 308 (5954): 32–6. Bibcode:1984Натура 308 ... 32А. Дои:10.1038 / 308032a0. PMID 6322001. S2CID 4319199.
  9. ^ Деллисанти, Косма (2015). «Резолюция, разрушающая барьеры». Структурная и молекулярная биология природы. 22 (5): 361. Дои:10.1038 / nsmb.3025. S2CID 12198387.
  10. ^ Кэмпбелл М.Г., Вислер Д., Ченг А., Поттер С.С., Каррагер Б. (март 2015 г.). «Реконструкция протеасомы Thermoplasma acidophilum 20S с разрешением 2,8 Å с использованием криоэлектронной микроскопии». eLife. 4. Дои:10.7554 / eLife.06380. ЧВК 4391500. PMID 25760083.
  11. ^ Бартесаги А., Мерк А., Банерджи С., Мэттис Д., Ву Х, Милн Дж. Л., Субраманиам С. (июнь 2015 г.). «Крио-ЭМ структура с разрешением 2,2 Å β-галактозидазы в комплексе с ингибитором проницаемости клеток». Наука. 348 (6239): 1147–51. Bibcode:2015Научный ... 348.1147B. Дои:10.1126 / science.aab1576. ЧВК 6512338. PMID 25953817.
  12. ^ Вонк Дж., Миллс диджей (октябрь 2017 г.). «Достижения в крио-ЭМ высокого разрешения олигомерных ферментов». Текущее мнение в структурной биологии. 46: 48–54. Дои:10.1016 / j.sbi.2017.05.016. PMID 28624735.
  13. ^ Сирохи Д., Чен З., Сан Л., Клозе Т., Пирсон Т.К., Россманн М.Г., Кун Р.Дж. (апрель 2016 г.). «КриоЭМ структура вируса Зика с разрешением 3,8 Å». Наука. 352 (6284): 467–70. Bibcode:2016Научный ... 352..467S. Дои:10.1126 / science.aaf5316. ЧВК 4845755. PMID 27033547.
  14. ^ Cheng Y (август 2018). "Одночастичная крио-ЭМ-как она попала сюда и куда пойдет". Наука. 361 (6405): 876–880. Дои:10.1126 / science.aat4346. ЧВК 6460916. PMID 30166484.
  15. ^ «Нобелевская премия по химии 2017 года - пресс-релиз». www.nobelprize.org. 4 октября 2017 г.. Получено 4 октября 2017.
  16. ^ Захман MJ, Asenath-Smith E, Estroff LA, Kourkoutis LF (декабрь 2016 г.). «Специальная подготовка неповрежденных границ раздела твердое тело-жидкость с помощью локализации на месте без этикеток и криофокусированного вывода ионного пучка». Микроскопия и микроанализ. 22 (6): 1338–1349. Bibcode:2016MiMic..22.1338Z. Дои:10.1017 / S1431927616011892. PMID 27869059.
  17. ^ Левин Б.Д., Захман М.Дж., Вернер Дж.Г., Сахор Р., Нгуен К.Х., Хан Й., Се Б., Ма Л., Арчер Л.А., Джаннелис Е.П., Виснер Ю., Куркутис Л.Ф., Мюллер Д.А. (февраль 2017 г.). «Определение характеристик серных и наноструктурированных серных аккумуляторных катодов в электронной микроскопии без артефактов сублимации». Микроскопия и микроанализ. 23 (1): 155–162. Bibcode:2017MiMic..23..155L. Дои:10.1017 / S1431927617000058. PMID 28228169.
  18. ^ Презентация по криоэлектронной микроскопии | PharmaXChange.info
  19. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., Иаданза М.Г., Гонен Т. (ноябрь 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография микрокристаллов белков». eLife. 2: e01345. Дои:10.7554 / eLife.01345. ЧВК 3831942. PMID 24252878.
  20. ^ Нанненга Б.Л., Ши Д., Лесли А.Г., Гонен Т. (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры с высоким разрешением путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED». Методы природы. 11 (9): 927–930. Дои:10.1038 / nmeth.3043. ЧВК 4149488. PMID 25086503.
  21. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., де ла Круз М.Дж., Лю Дж., Савтель С., Калеро Дж., Рейес Ф. Э., Хаттне Дж., Гонен Т. (май 2016 г.). «Сбор данных MicroED для кристаллографии макромолекул». Протоколы природы. 11 (5): 895–904. Дои:10.1038 / nprot.2016.046. ЧВК 5357465. PMID 27077331.
  22. ^ de la Cruz MJ, Hattne J, Shi D, Seidler P, Rodriguez J, Reyes FE, Sawaya MR, Cascio D, Weiss SC, Kim SK, Hinck CS, Hinck AP, Calero G, Eisenberg D, Gonen T. (февраль 2017 г.) . «Структуры с атомным разрешением из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED». Методы природы. 14 (4): 399–402. Дои:10.1038 / nmeth.4178. ЧВК 5376236. PMID 28192420.
  23. ^ Фу З., Каледхонкар С., Борг А., Сун М., Чен Б., Грассуччи Р.А., Эренберг М., Франк Дж. (Декабрь 2016 г.). «Ключевые промежуточные продукты в рециклинге рибосом, визуализированные с помощью криоэлектронной микроскопии с временным разрешением». Структура. 24 (12): 2092–2101. Дои:10.1016 / j.str.2016.09.014. ЧВК 5143168. PMID 27818103.
  24. ^ Фэн Х, Фу З, Каледхонкар С., Цзя Й, Шах Б., Джин А., Лю З., Сун М., Чен Б., Грассуччи Р. А., Рен Й, Цзян Х, Франк Дж., Линь Q (апрель 2017 г.). «Быстрый и эффективный метод микрожидкостного распыления-погружения для крио-ЭМ одиночных частиц с высоким разрешением». Структура. 25 (4): 663–670.e3. Дои:10.1016 / j.str.2017.02.005. ЧВК 5382802. PMID 28286002.
  25. ^ Чен Б., Каледхонкар С., Сун М., Шен Б., Лу З., Барнард Д., Лу Т.М., Гонсалес Р.Л., Франк Дж. (Июнь 2015 г.). «Структурная динамика ассоциации субъединиц рибосомы изучена с помощью криогенной электронной микроскопии с временным разрешением». Структура. 23 (6): 1097–105. Дои:10.1016 / j.str.2015.04.007. ЧВК 4456197. PMID 26004440.

дальнейшее чтение

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Криомикроскопия