WikiDer > Бесклеточный синтез белка

Cell-free protein synthesis

Бесклеточный синтез белка, также известный как in vitro синтез белка или же CFPS, это производство белок с помощью биологический машины в бесклеточная система, то есть без использования живого клетки. В in vitro среда синтеза белка не ограничена клеточная стенка или же гомеостаз условия, необходимые для поддержания жизнеспособности клеток.[1] Таким образом, CFPS обеспечивает прямой доступ и контроль над перевод среда, которая является выгодной для ряда применений, включая совместную трансляционную солюбилизацию мембранных белков, оптимизацию продукции белка, включение неприродных аминокислот, селективное и сайт-специфическое мечение.[2][3] Из-за открытой природы системы различные условия экспрессии, такие как pH, окислительно-восстановительные потенциалы, температуры и шапероны можно проверить. Поскольку нет необходимости поддерживать жизнеспособность клеток, могут производиться токсичные белки.

Вступление

Общие компоненты бесклеточной реакции включают клеточный экстракт, источник энергии, запас аминокислоты, кофакторы Такие как магний, а ДНК с желаемым гены. Клеточный экстракт получают лизать интересующая ячейка и центрифугирование из клеточных стенок, ДНК геном, и прочий мусор. Останки - необходимый клеточный аппарат, в том числе рибосомы, аминоацил-тРНК синтетазы, инициирование перевода и факторы удлинения, нуклеазы, так далее.

В CFPS можно использовать два типа ДНК: плазмиды и шаблоны линейных выражений (Давайте). Плазмиды имеют круглую форму и образуются только внутри клеток. LET можно сделать намного эффективнее с помощью ПЦР , который реплицирует ДНК намного быстрее, чем выращивание клеток в инкубатор. Хотя LET проще и быстрее сделать, выход плазмид обычно намного выше в CFPS. Из-за этого многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов ЛПЭ CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с плазмидами.

Источник энергии - важная часть бесклеточной реакции. Обычно для реакции в экстракт добавляют отдельную смесь, содержащую необходимый источник энергии, а также запас аминокислот. Общие источники фосфоенолпируват, ацетилфосфат, и креатинфосфат.

Преимущества и применение

CFPS имеет много преимуществ перед традиционными in vivo синтез белков. В частности, бесклеточная реакция, включая приготовление экстракта, обычно занимает 1-2 дня, тогда как in vivo экспрессия белка может занять 1-2 недели.[4][5][6][7]

CFPS - открытая реакция. Отсутствие клеточной стенки позволяет напрямую управлять химической средой. Легко отбираются пробы, оптимизируются концентрации и можно отслеживать реакцию. Напротив, после того, как ДНК вставлена ​​в живые клетки, реакция становится недоступной, пока она не закончится и клетки не будут лизированы.

Еще одно преимущество CFPS - отсутствие опасений по поводу токсичности. Некоторые желаемые белки и меченые белки токсичны для клеток при синтезе.[8]Поскольку живые клетки не используются, токсичность продукта-белка не вызывает серьезного беспокойства.

Эти преимущества позволяют использовать множество приложений[9].[1] Основное применение CFPS - включение неприродных аминокислот в белковые структуры (видеть расширенный генетический код). Открытость реакции идеальна для вставки модифицированного тРНК и неприродные аминокислоты, необходимые для такой реакции.

Синтетическая биология имеет много других применений и имеет светлое будущее в таких областях, как эволюция белка, наномашины, цепи нуклеиновых кислот, и синтез вирус-подобные частицы для вакцина и лекарственная терапия.[10][11][12]

Ограничения

Одна из проблем, связанных с CFPS, - это деградация ДНК под действием эндогенный нуклеазы в клеточном экстракте. Это особенно проблематично с LET. Клетки имеют эндонуклеазы которые атакуют случайные участки цепей ДНК; однако гораздо чаще встречаются экзонуклеазы которые атакуют ДНК с концов. Поскольку плазмиды имеют круглую форму и не имеют конца, к которому могут присоединяться экзонуклеазы, последние на них не влияют. Однако ЛПЭ подвержены обоим. Из-за уязвимости LET, многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов LET CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с использованием плазмид.

Одним из примеров этой улучшенной защиты с помощью плазмид является использование бактериофаг лямбда гамма-белок.[13] Гам - ингибитор RecBCD, экзонуклеаза, обнаруженная в кишечная палочка (Кишечная палочка).[14] При использовании гамма-излучения выходы CFPS с LET были значительно увеличены и были сопоставимы с выходами CFPS с плазмидами.[15] Также могут быть получены экстракты PURE, устраняющие опасения, связанные с экзонуклеазами. Эти экстракты дороги в производстве и в настоящее время не являются экономичным решением проблемы экзогенной деградации ДНК.

Типы бесклеточных систем

Распространенные экстракты клеток, используемые сегодня, производятся из Кишечная палочка (ЕЭК), кролик ретикулоциты (RRL), ростки пшеницы (WGE), насекомое клетки (ICE) и дрожжи Kluyveromyces (система D2P).[1][5] Все эти экстракты коммерчески доступны.

ЕЭК - самый популярный лизат по нескольким причинам. Это самый недорогой экстракт, и его создание требует минимальных затрат времени. Также большое количество Кишечная палочка легко выращиваются, а затем легко лизируются при использовании гомогенизатор или соникатор.[1] ECE также обеспечивает самый высокий выход белка. Однако производство с высоким выходом может ограничить сложность синтезируемого белка, особенно в посттрансляционная модификация. В связи с этим более низкая эффективность эукариотический системы могут быть полезны при условии, что изменение фермент системы сохранены в экстрактах.

У каждой эукариотической системы есть свои преимущества и недостатки. Например, экстракт WGE дает самый высокий выход из трех экстрактов эукариот; однако он не так эффективен для некоторых пост-трансляционных модификаций, таких как гликозилирование.[5] При выборе экстракта следует учитывать тип посттрансляционной модификации, желаемые урожаи и стоимость.

История

Бесклеточный синтез белка использовался более 60 лет, и это, в частности, первое объяснение кодон было сделано Маршалл Ниренберг и Генрих Дж. Маттеи в 1961 году в Национальном институте здоровья.[1][16] Они использовали бесклеточную систему для перевода поли-урацил РНК последовательность (или УУУУУ ... в биохимический условия) и обнаружил, что полипептид они синтезировали состояли только из аминокислоты фенилаланин. Таким образом, они сделали вывод из этого полифенилаланина, что кодон UUU определяет аминокислоту фенилаланин. Расширяя эту работу, Ниренберг и его коллеги смогли определить нуклеотидный состав каждого кодона.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c d е Грегорио, Николь Э .; Левин, Макс З .; Оза, Джавин П. (2019). «Руководство пользователя по внеклеточному синтезу белка». Методы и протоколы. 2 (1): 24. Дои:10,3390 / м / с.
  2. ^ Роос, С; Кай, Л; Haberstock, S; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Май; Филипек, S; Ван, Х; Dötsch, V; Бернхард, Ф (2014). «Высокоуровневая бесклеточная продукция мембранных белков с нанодисками». Бесклеточный синтез белка. Методы молекулярной биологии. 1118. С. 109–30. Дои:10.1007/978-1-62703-782-2_7. ISBN 978-1-62703-781-5. PMID 24395412.
  3. ^ Роос, С; Кай, Л; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Филипек, S; Dötsch, V; Бернхард, Ф (2013). «Ко-трансляционная ассоциация внеклеточных экспрессируемых мембранных белков с поставляемыми липидными бислоями». Молекулярная мембранная биология. 30 (1): 75–89. Дои:10.3109/09687688.2012.693212. PMID 22716775.
  4. ^ Ма Y, Ghoshdastider U, Wang J, Ye W, Dötsch V, Filipek S, Bernhard F, Wang X (2012). «Бесклеточная экспрессия человеческой глюкозамин 6-фосфат N-ацетилтрансферазы (HsGNA1) для скрининга ингибиторов». Protein Expr. Purif. 86 (2): 120–6. Дои:10.1016 / j.pep.2012.09.011. PMID 23036358.
  5. ^ а б c Карлсон Э.Д., Ган Р., Ходжман К.Э., Джеветт М.С. (2012). «Бесклеточный синтез белка: приложения достигли совершеннолетия». Biotechnol. Adv. 30 (5): 1185–94. Дои:10.1016 / j.biotechadv.2011.09.016. ЧВК 4038126. PMID 22008973.
  6. ^ Левин, Макс З .; Грегорио, Николь Э .; Джеветт, Майкл С.; Уоттс, Кэтрин Р .; Оза, Джавин П. (25 февраля 2019 г.). «Бесклеточный синтез белка на основе Escherichia coli: протоколы для надежной, гибкой и доступной платформенной технологии». Журнал визуализированных экспериментов (144). Дои:10.3791/58882. ISSN 1940-087X.
  7. ^ https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.00941/
  8. ^ Джексон AM (2004). «Бесклеточный синтез белка для протеомики». Брифинги по функциональной геномике и протеомике. 2 (4): 308–319. Дои:10.1093 / bfgp / 2.4.308. ISSN 1473-9550.
  9. ^ https://cellfreesystems.org/
  10. ^ Банди, Брэдли С.; Franciszkowicz, Marc J .; Шварц, Джеймс Р. (2008). «Бесклеточный синтез вирусоподобных частиц на основе Escherichia coli». Биотехнологии и биоинженерия. 100 (1): 28–37. Дои:10.1002 / бит. 21716. PMID 18023052.
  11. ^ Патриархи Т., Шен А., Хе В., Байкогли М., Ченг Р.Х., Сян Ю.К., Коулман М.А., Тиан Л. (2018). «Нанодоставка функционального мембранного рецептора для управления клеточным фенотипом». Sci. Представитель. 8 (1): 3556. Bibcode:2018НатСР ... 8.3556П. Дои:10.1038 / s41598-018-21863-3. ЧВК 5824837. PMID 29476125.
  12. ^ Тинафар, Эйдан; Хаэнес, Катарина; Парди, Кейт (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной». BMC Биология. 17 (1). Дои:10.1186 / s12915-019-0685-х.
  13. ^ «gam - белок ингибитор нуклеазы хозяина gam - фаг Escherichia lambda - ген и белок gam». www.uniprot.org. Получено 2017-10-20.
  14. ^ Мерфи, Кенан С. (2007). «Gam-белок ингибирует связывание RecBCD с концами дцДНК». Журнал молекулярной биологии. 371 (1): 19–24. Дои:10.1016 / j.jmb.2007.05.085. PMID 17583735.
  15. ^ Ситараман, Калавати; Эспозито, Доминик; Кларманн, Джордж; Грайс, Стюарт Ф. Ле; Хартли, Джеймс Л; Чаттерджи, Деб К. (2004). «Новая система бесклеточного синтеза белка». Журнал биотехнологии. 110 (3): 257–263. Дои:10.1016 / j.jbiotec.2004.02.014. PMID 15163516.
  16. ^ Nirenberg, M. W .; Маттеи, Дж. Х. (1961). «Зависимость внеклеточного синтеза белка в E. Coli от природных или синтетических полирибонуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 47 (10): 1588–1602. Bibcode:1961ПНАС ... 47.1588Н. Дои:10.1073 / pnas.47.10.1588. ЧВК 223178. PMID 14479932.
  • Спирин, А .; Баранов, В .; Рябова, Л .; Оводов, С .; Алахов Ю. (1988). «Непрерывная бесклеточная система трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом». Наука. 242 (4882): 1162–4. Bibcode:1988Научный ... 242.1162С. Дои:10.1126 / science.3055301. PMID 3055301.

дальнейшее чтение