WikiDer > ДНК-направленная интерференция РНК

DNA-directed RNA interference

ДНК-направленная интерференция РНК (ддРНКи) это подавление генов метод, который использует конструкции ДНК для активации эндогенных клеток животных. РНК-интерференция (РНКи) пути. Конструкции ДНК предназначены для экспрессии самокомплементарных двухцепочечных РНК, обычно коротких шпилечных РНК (shRNA), которые после обработки вызывают молчание целевого гена или генов.[1] Любая РНК, включая эндогенные мРНК или вирусные РНК, может быть подавлена ​​путем создания конструкций для экспрессии двухцепочечной РНК, комплементарной желаемой. мРНК цель.

Этот механизм имеет большой потенциал в качестве нового терапевтического средства для подавления болезней генов. Подтверждение концепции было продемонстрировано на ряде моделей заболеваний, включая вирусные заболевания, такие как ВИЧ,[2] гепатит Б[3] или же гепатит С,[4] или заболевания, связанные с измененной экспрессией эндогенных генов, таких как лекарственно-устойчивые рак легких,[5] невропатическая боль,[6] распространенный рак [7] и пигментный ретинит.[8]

текст
Рисунок 1: механизм действия ddRNAi

механизм ddRNAi

Как видно на рисунке 1, конструкция ддРНКи, кодирующая кшРНК, упакована в комплект поставки. вектор или реагент, специально предназначенный для конкретных клеток. Внутри клетки ДНК транспортируется в ядро, где транскрипция машины постоянно производят закодированные РНК. Затем молекулы shRNA обрабатываются эндогенными системами и попадают в РНКи путь и замолчать желаемые гены.[1]

Долгосрочная деятельность

В отличие от малых интерферирующих РНК (миРНК) терапевтических средств, которые поворачиваются внутри клетки и, следовательно, только временно заглушают гены, конструкции ДНК непрерывно транскрибируются, пополняя клеточную «дозу» shРНК, тем самым обеспечивая длительное молчание генов-мишеней. Механизм ddRNAi, таким образом, предлагает потенциал для постоянной клинической пользы при меньшем медицинском вмешательстве.[2][4]

Организация конструкций ddRNAi

На рисунке 2 показан наиболее распространенный тип конструкции ДНК ddRNAi, которая предназначена для экспрессии shRNA. Он состоит из промоторной последовательности, управляющей экспрессией смысловой и антисмысловой последовательностей, разделенных последовательностью петли, за которой следует терминатор транскрипции. Антисмысловые частицы, обработанные из shRNA, могут связываться с целевой РНК и определять ее деградацию. Конструкции shRNA обычно кодируют смысловые и антисмысловые последовательности из 20-30 нуклеотидов. Возможна гибкость в конструкции конструкции: например, положения смысловой и антисмысловой последовательностей могут быть изменены, а другие модификации и добавления могут изменить процессинг внутриклеточной кшРНК.[9] Кроме того, можно использовать множество последовательностей промоторной петли и терминатора.[4]

текст
Рисунок 2: ДНК-конструкции ddRNAi

Особенно полезный вариант - это мульти-кассета (рис. 2b). Разработанные для экспрессии двух или более shРНК, они могут одновременно нацеливаться на несколько последовательностей для деградации. Это особенно полезная стратегия для борьбы с вирусами. Вариации естественной последовательности могут сделать один сайт-мишень shRNA нераспознаваемым, предотвращая деградацию РНК. Мультикассетные конструкции, нацеленные на несколько сайтов в одной и той же вирусной РНК, позволяют обойти эту проблему.[4]

Доставка

Доставка ДНК-конструкций ддРНКи упрощается благодаря наличию ряда клинически одобренных и хорошо изученных генная терапия векторы, разработанные для этой цели. Доставка является серьезной проблемой для терапии на основе РНКи, поскольку постоянно разрабатываются новые модификации и реагенты для оптимизации доставки клеток-мишеней. Доступны две широкие стратегии для облегчения доставки конструкций ДНК в желаемые клетки: в них используются либо вирусные векторы, либо один из нескольких классов трансфекция реагенты.

В естественных условиях Доставка конструкций ddRNAi была продемонстрирована с использованием ряда векторов и реагентов с различными путями введения (ROA).[3][4][6][8]

Конструкции ddRNAi также были успешно доставлены в клетки-хозяева ex vivo, а затем пересаживают обратно в хозяина.[2][7][10]

Например, в клиническом исследовании фазы I в Национальный медицинский центр "Город надежды", Калифорния, США, четыре ВИЧ-инфицированных пациента с неходжкинской лимфомой успешно прошли курс лечения аутологичной гемопоэтические клетки-предшественники предварительно трансдуцированные ex vivo конструкциями ддРНКи с использованием лентивирусных векторов. Эта конструкция была разработана для экспрессии трех терапевтических РНК, одна из которых была кшРНК, тем самым борясь с репликацией ВИЧ тремя различными способами:[2]

  • shRNA, которая заглушает гены tat и rev генома ВИЧ
  • Рибозим CCR5, ингибирующий проникновение в вирусные клетки
  • РНК-ловушка TAR, ингибирующая инициацию вирусной транскрипции.

Продолжающаяся экспрессия shРНК была подтверждена в Т-клетках, моноцитах и ​​В-клетках более чем через год после трансплантации.[2]

Терапевтические приложения

Невропатическая боль

Nervana - это исследуемая конструкция ддРНКи, которая подавляет экспрессию протеинкиназа C гамма (PKCγ), как известно, связано с невропатическая боль и толерантность к морфину.[6]

Были идентифицированы две консервативные последовательности PKCγ, обнаруженные у всех ключевых модельных видов и людей, и созданы как одиночные, так и двойные кассеты ДНК. In vitro экспрессия PKCγ подавлялась на 80%. Когда аналогичные конструкции ddRNAi были доставлены интратекально с использованием лентивирусного вектора, было продемонстрировано облегчение боли на модели нейропатической крысы.[6]

Лекарственно-устойчивый немелкоклеточный рак легкого

Развитие устойчивости к химиотерапии, такой как паклитаксел и цисплатин в немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) тесно связан с избыточной экспрессией бета III тубулин. Исследования Детского онкологического института Австралии (Университет Нового Южного Уэльса, Центр исследования рака Лоуи) продемонстрировали, что нокдаун бета III-тубулина ddRNAi задерживает рост опухоли и увеличивает химиочувствительность на моделях мышей.[5]

Трибутарна представляет собой тройную кассету ДНК, экспрессирующую три молекулы shРНК, каждая из которых по отдельности нацелена на тубулин бета III и сильно ингибирует его экспрессию. Исследования на модели ортотопической мыши, где конструкция доставляется модифицированным полиэтиленимин вектор, jetPEI, который нацелен на легочную ткань.

Вирусная инфекция гепатита В

Геном вируса гепатита B (HBV) кодирует собственный ДНК-полимераза для тиражирования. Biomics Biotechnologies провела оценку около 5000 последовательностей siRNA этого гена на предмет эффективного нокдауна; пять последовательностей были выбраны для дальнейшего исследования, и было показано, что они обладают мощной активностью по подавлению звука при преобразовании в кассеты экспрессии shRNA. Мультикассетная конструкция Hepbarna находится в стадии доклинической разработки для доставки специалистом. аденоассоциированный вирус 8 (AAV-8) вектор, нацеленный на печень.

Окулофарингеальная мышечная дистрофия

Классифицируется как сиротская болезнь, в настоящее время не существует терапии OPMD, вызванной мутацией в ядерном 1 связывающем поли (A) белке (PABPN1) ген. Молчание мутантного гена с помощью ddRNAi предлагает потенциальный терапевтический подход.[11]

ВИЧ / СПИД

Помимо подхода ex vivo Национальный медицинский центр "Город надежды" Как обсуждалось выше, Амстердамский центр инфекций и иммунитета (CINIMA) при Амстердамском университете, Нидерланды, активно изучает состав многокассетных ДНК-конструкций для борьбы с ВИЧ.[12]

Соображения безопасности

Как и все генная терапия, при разработке терапевтических средств ddRNAi необходимо оценить ряд вопросов безопасности и токсичности:

Активация онкогена путем вставки вируса: некоторые векторы генной терапии интегрируются в геном хозяина, тем самым действуя как инсерционные мутагены. Это была особая проблема с ранними ретровирусными векторами, где вставки, прилегающие к онкогены привело к развитию лимфоидных опухолей.[13] Векторы AAV считаются малым риском интеграции генома хозяина, поскольку аденоассоциированный вирус инфекция не была связана с индукцией рака у людей, несмотря на широкую распространенность среди населения в целом. Более того, широкое клиническое использование векторов AAV не дало доказательств канцерогенности. Хотя лентивирусные векторы действительно интегрируются в геном, они, по-видимому, не проявляют склонности к активации экспрессии онкогенов.[14]

Иммунный ответ на векторы генной терапии: иммунологический ответ на аденовирусный вектор привел к смерти пациента в раннем испытании на людях. Тщательный мониторинг потенциальной токсичности в ходе доклинических испытаний и анализов уже существующих антител к векторам генной терапии у пациентов сводит к минимуму такие риски.

Врожденный иммунный ответ: было показано, что siRNA активируют иммунные ответы посредством взаимодействия с Toll-подобными рецепторами, что приводит к ответам интерферона. Эти рецепторы располагаются на поверхности клеток, поэтому не ожидается, что конструкции ddRNAi, доставленные непосредственно во внутриклеточное пространство, будут вызывать этот ответ.[15]

Токсические эффекты из-за чрезмерной экспрессии shРНК: было показано, что высокий уровень экспрессии shRNA является токсичным. Стратегии минимизации уровней экспрессии shRNA[4] или способствовать точной обработке shRNAs[16] может преодолеть эту проблему.

Нецелевые эффекты: теоретически может произойти непреднамеренное подавление генов, которые имеют гомологию последовательностей с экспрессируемыми shРНК.[17] Тщательный отбор последовательностей shRNA и тщательное доклиническое тестирование конструкций позволяют обойти эту проблему.

дальнейшее чтение

  • Rice, R. R .; Muirhead, A.N .; Harrison, B.T .; Kassianos, A.J .; Sedlak, P. L .; Maugeri, N.J .; Госс, П. Дж .; Davey, J. R .; Джеймс, Д. Э .; Грэм, М. В. (2005). Простые и надежные стратегии создания ДНК-направленных конструкций интерференции РНК. Методы в энзимологии. 392. С. 405–419. Дои:10.1016 / S0076-6879 (04) 92024-1. ISBN 9780121827977. PMID 15644195.
  • Liu, Y. P .; Westerink, J. T .; Тормоз, О .; Беркхоут, Б. (2011). «РНКи-индуцирующие лентивирусные векторы для генной терапии против ВИЧ-1». Противовирусные РНКи. Методы молекулярной биологии. 721. С. 293–311. Дои:10.1007/978-1-61779-037-9_18. ISBN 978-1-61779-036-2. PMID 21431693.

Рекомендации

  1. ^ а б Lambeth, L. S .; Смит, К. А. (2013). "Короткая шпилька РНК-опосредованное молчание гена". SiRNA Дизайн. Методы молекулярной биологии. 942. С. 205–232. Дои:10.1007/978-1-62703-119-6_12. ISBN 978-1-62703-118-9. PMID 23027054.
  2. ^ а б c d е Digiusto, D. L .; Кришнан, А .; Li, L .; Li, H .; Li, S .; Rao, A .; Mi, S .; Yam, P .; Стинсон, С .; Kalos, M .; Alvarnas, J .; Лейси, С. Ф .; Yee, J. -K .; Li, M .; Couture, L .; Hsu, D .; Forman, S.J .; Росси, Дж. Дж .; Зайя, Дж. А. (2010). «РНК-основанная генная терапия ВИЧ с использованием модифицированных лентивирусным вектором клеток CD34 + у пациентов, перенесших трансплантацию лимфомы, связанной со СПИДом». Научная трансляционная медицина. 2 (36): 36ra43. Дои:10.1126 / scitranslmed.3000931. ЧВК 3130552. PMID 20555022.
  3. ^ а б Chen, C. -C .; Chang, C. -M .; Sun, C. -P .; Yu, C. -P .; Wu, P. -Y .; Jeng, K. -S .; Hu, C. -P .; Chen, P. -J .; Wu, J. -C .; Shih, C.H .; Гершвин, М. Э .; Тао, М. -H. (2011). «Использование РНК-интерференции для модуляции развития аденомы печени на мышиной модели, трансгенной по вирусу гепатита B». Генная терапия. 19 (1): 25–33. Дои:10.1038 / gt.2011.60. PMID 21562593.
  4. ^ а б c d е ж Сухи, Д. А .; Kao, S.C .; Mao, T .; Whiteley, L .; Дениз, H .; Souberbielle, B .; Burdick, A.D .; Hayes, K .; Wright, J. F .; Lavender, H .; Roelvink, P .; Колыхалов, А .; Brady, K .; Moschos, S.A .; Hauck, B .; Зеленая, О .; Чжоу, S .; Scribner, C .; High, K. A .; Renison, S. H .; Корбау Р. (2012). «Безопасная, долговременная печеночная экспрессия кшРНК против HCV на нечеловеческой модели приматов». Молекулярная терапия. 20 (9): 1737–1749. Дои:10,1038 / мт.2012.119. ЧВК 3437581. PMID 22735378.
  5. ^ а б McCarroll, J. A .; Gan, P. P .; Лю, М .; Кавалларис, М. (2010). «III-Тубулин - это многофункциональный белок, участвующий в чувствительности к лекарственным препаратам и опухолевом генезе немелкоклеточного рака легкого». Исследования рака. 70 (12): 4995–5003. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-09-4487. PMID 20501838.
  6. ^ а б c d Zou, W .; Песня, З .; Guo, Q .; Liu, C .; Zhang, Z .; Чжан, Ю. (2011). «Интратекально опосредованная лентивирусами РНК-интерференция, направленная на PKCγ, ослабляет нейропатическую боль, вызванную хронической суженной травмой у крыс». Генная терапия человека. 22 (4): 465–475. Дои:10.1089 / hum.2010.207. PMID 21087146.
  7. ^ а б Senzer, N .; Barve, M .; Kuhn, J .; Мельник, А .; Beitsch, P .; Лазарь, М .; Лифшиц, С .; Magee, M .; О, Дж .; Mill, S.W .; Bedell, C .; Higgs, C .; Kumar, P .; Yu, Y .; Norvell, F .; Phalon, C .; Taquet, N .; Rao, D. D .; Wang, Z .; Jay, C.M .; Pappen, B.O .; Wallraven, G .; Brunicardi, F.C .; Shanahan, D. M .; Maples, P. B .; Немунайтис, Дж. (2011). «Фаза I испытания вакцины би-shРНКифурин / ДНК GMCSF / аутологичных опухолевых клеток (FANG) при запущенном раке». Молекулярная терапия. 20 (3): 679–686. Дои:10.1038 / мт.2011.269. ЧВК 3293620. PMID 22186789.
  8. ^ а б Millington-Ward, S .; Chadderton, N .; О'Рейли, М .; Palfi, A .; Goldmann, T .; Килти, К .; Humphries, M .; Wolfrum, U .; Bennett, J .; Humphries, P .; Kenna, P. F .; Фаррар, Дж. Дж. (2011). «Подавление и заместительная генная терапия аутосомно-доминантного заболевания на мышиной модели доминантного пигментного ретинита». Молекулярная терапия. 19 (4): 642–649. Дои:10.1038 / мт.2010.293. ЧВК 3070095. PMID 21224835.
  9. ^ Gu, S .; Jin, L .; Zhang, Y .; Huang, Y .; Zhang, F .; Вальдманис, П. Н .; Кей, М.А. (2012). «Положение петли shRNA и пре-miRNA имеет решающее значение для точности обработки дайсером in vivo». Клетка. 151 (4): 900–911. Дои:10.1016 / j.cell.2012.09.042. ЧВК 3499986. PMID 23141545.
  10. ^ Ringpis, G.E.E .; Shimizu, S .; Arokium, H .; Camba-Colón, J .; Кэрролл, М. В .; Cortado, R .; Xie, Y .; Kim, P. Y .; Саакян А .; Lowe, E. L .; Нарукава, М .; Кандарян, Ф. Н .; Burke, B.P .; Symonds, G.P .; An, D. S .; Chen, I. S .; Камата, М. (2012). Спек, Роберто Ф (ред.). «Конструирование устойчивых к ВИЧ-1 Т-клеток из короткошпилочных РНК-экспрессирующих гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников у гуманизированных мышей BLT». PLOS ONE. 7 (12): e53492. Bibcode:2012PLoSO ... 753492R. Дои:10.1371 / journal.pone.0053492. ЧВК 3534037. PMID 23300932.
  11. ^ Троллет, Ц .; Anvar, S. Y .; Венема, А .; Hargreaves, I.P .; Фостер, К .; Vignaud, A .; Ферри, А .; Negroni, E .; Hourde, C .; Baraibar, M.A .; "t" hoen, P.A.C .; Davies, J. E .; Рубинштейн, Д. С .; Heales, S.J .; Мулы, В .; Van Der Maarel, S.M .; Батлер-Браун, G .; Раз, В .; Диксон, Г. (2010). «Молекулярная и фенотипическая характеристика мышиной модели окулофарингеальной мышечной дистрофии выявляет тяжелую мышечную атрофию, ограниченную быстрыми гликолитическими волокнами». Молекулярная генетика человека. 19 (11): 2191–2207. Дои:10.1093 / hmg / ddq098. PMID 20207626.
  12. ^ Тормоз, О. Т .; Хоофт, К. 'Т .; Liu, Y. P .; Centlivre, M .; Jasmijn Von Eije, K .; Беркхоут, Б. (2008). «Дизайн лентивирусного вектора для множественной экспрессии shРНК и стойкого ингибирования ВИЧ-1». Молекулярная терапия. 16 (3): 557–564. Дои:10.1038 / sj.mt.6300382. PMID 18180777.
  13. ^ Woods, N.B .; Боттеро, В .; Schmidt, M .; Von Kalle, C .; Верма, И. М. (2006). «Генная терапия: терапевтический ген, вызывающий лимфому». Природа. 440 (7088): 1123. Bibcode:2006 Натур.440.1123W. Дои:10.1038 / 4401123a. PMID 16641981. S2CID 4372110.
  14. ^ Wang, G.P .; Levine, B.L .; Binder, G.K .; Berry, C.C .; Malani, N .; McGarrity, G .; Тебас, П .; June, C. H .; Бушман, Ф. Д. (2009). «Анализ интеграции лентивирусного вектора в ВИЧ + исследуемых субъектов, получающих аутологичные инфузии генетически модифицированных CD4 + Т-клеток». Молекулярная терапия. 17 (5): 844–850. Дои:10.1038 / мт.2009.16. ЧВК 2835137. PMID 19259065.
  15. ^ Kleinman, M.E .; Yamada, K .; Takeda, A .; Чандрасекаран, V .; Нодзаки, М .; Baffi, J. Z .; Albuquerque, R.J.C .; Yamasaki, S .; Itaya, M .; Pan, Y .; Appukuttan, B .; Gibbs, D .; Ян, З .; Карико, К .; Ambati, B.K .; Wilgus, T. A .; Дипьетро, ​​Л. А .; Sakurai, E .; Zhang, K .; Smith, J. R .; Тейлор, Э. У .; Амбати, Дж. (2008). «Последовательность и независимое от мишени подавление ангиогенеза с помощью миРНК через TLR3». Природа. 452 (7187): 591–597. Bibcode:2008Натура.452..591K. Дои:10.1038 / природа06765. ЧВК 2642938. PMID 18368052.
  16. ^ McBride, J. L .; Boudreau, R.L .; Harper, S. Q .; Staber, P.D .; Monteys, A.M .; Мартинс, И .; Gilmore, B.L .; Burstein, H .; Peluso, R.W .; Полиски, Б .; Картер, Б. Дж .; Дэвидсон, Б. Л. (2008). «Искусственные miRNAs уменьшают shRNA-опосредованную токсичность в головном мозге: значение для терапевтического развития RNAi». Труды Национальной академии наук. 105 (15): 5868–5873. Bibcode:2008ПНАС..105.5868М. Дои:10.1073 / pnas.0801775105. ЧВК 2311380. PMID 18398004.
  17. ^ Джексон, А. Л .; Bartz, S. R .; Schelter, J .; Кобаяси, С. В .; Burchard, J .; Mao, M .; Li, B .; Cavet, G .; Линсли, П. С. (2003). «Профили экспрессии выявляют регуляцию нецелевого гена с помощью РНКи». Природа Биотехнологии. 21 (6): 635–637. Дои:10.1038 / nbt831. PMID 12754523. S2CID 24778534.