WikiDer > Идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы

DNA adenine methyltransferase identification

Идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы, часто сокращенно DamID,[1] это молекулярная биология протокол, используемый для сопоставления сайтов привязки ДНК- и хроматинпереплет белки в эукариоты. DamID идентифицирует сайты связывания, экспрессируя предложенный ДНК-связывающий белок как гибридный белок с ДНК-метилтрансфераза. Связывание интересующего белка с ДНК локализует метилтрансферазу в области сайта связывания. Аденин Метилирование не происходит в природе у эукариот, и поэтому можно сделать вывод, что метилирование аденина в любой области вызвано слитым белком, подразумевая, что область расположена рядом с сайтом связывания. DamID - альтернативный метод Чип-на-чипе или же ChIP-seq.[2]

Описание

Принцип

какая-то блабла.
Принцип DamID. Этот эскиз показывает идеализированный вид молекулы ДНК, обернутой вокруг гистоны внутри ядра клетки. Фермент Dam (зеленый) сливается с интересующим белком (оранжевый) посредством экспрессии химерной последовательности ДНК. Интересующий белок притягивает Dam к своим родственным целям. Привязка приводит к метилированию GATC поблизости от сайта связывания (красный), но не на расстоянии.

N6-метиладенин (m6A) является продуктом присоединения метильной группы (CH3) в позиции 6 аденина. Этот модифицированный нуклеотид отсутствует у подавляющего большинства эукариот, за исключением C. elegans,[3] но широко распространен в бактериальных геномах,[4] как часть изменение ограничения или же Ремонт ДНК системы. В кишечная палочка, метилирование аденина катализируется аденинметилтрансферазой Плотина (ДНК-аденин-метилтрансфераза), которая катализирует метилирование аденина исключительно в палиндромной последовательности GATC. Эктопическая экспрессия Dam в эукариотических клетках приводит к метилированию аденина в последовательностях GATC без каких-либо других заметных побочных эффектов.

Исходя из этого, DamID состоит в слиянии Dam с интересующим белком (обычно с белком, который взаимодействует с ДНК, например факторы транскрипции) или хроматиновый компонент. Таким образом, интересующий белок нацелен на Dam на его родственный in vivo сайт связывания, что приводит к метилированию соседних GATC. Присутствие m6A, совпадающего с сайтами связывания интересующих белков, выявляется с помощью метил ПЦР.

Метил ПЦР

В этом анализе геном переваривается DpnI, который отсекает только метилированные GATC. Затем двухцепочечные адаптеры с известной последовательностью лигируют с концами, генерируемыми DpnI. Затем продукты лигирования перевариваются ДПНИИ. Этот фермент разрезает неметилированные GATC, гарантируя, что только фрагменты, фланкированные последовательный метилированные GATC амплифицируются в последующей ПЦР. Затем проводят ПЦР с праймерами, соответствующими адаптерам, что приводит к специфической амплификации геномных фрагментов, фланкированных метилированными GATC.

Особенности DamID по сравнению с иммунореципитацией хроматина

Иммунореципитация хроматина, или (ChIP), представляет собой альтернативный метод анализа связывания белков в определенных локусах генома. В отличие от ChIP, DamID не требует специального антитело против интересующего белка. С одной стороны, это позволяет картировать белки, для которых нет таких антител. С другой стороны, это делает невозможным конкретное отображение посттрансляционно модифицированный белки.

Еще одно фундаментальное отличие состоит в том, что ChIP анализирует, где интересующий белок является в определенный момент времени, тогда как DamID анализирует, где он был. Причина в том, что m6A остается в ДНК после того, как слитый белок Dam уходит. Для белков, которые связаны или не связаны на своих сайтах-мишенях, это не меняет общей картины. Однако это может привести к сильным различиям в случае белков, скользящих по ДНК (например РНК-полимераза).

Известные предубеждения и технические проблемы

Ошибка метилирования плазмид

В зависимости от того, как проводится эксперимент, DamID может быть подвержен ошибкам в отношении метилирования плазмиды. Поскольку плазмиды обычно амплифицируются в Кишечная палочка где Dam экспрессируется естественным образом, они метилируются на каждом GATC. В переходный трансфекция В экспериментах ДНК этих плазмид восстанавливается вместе с ДНК трансфицированных клеток, что означает, что фрагменты плазмиды амплифицируются в метиловой ПЦР. Каждая последовательность генома, разделяющая гомология или, таким образом, может оказаться, что идентичность с плазмидой связана с представляющим интерес белком. В частности, это касается открытая рамка чтения интересующего белка, который присутствует как в плазмиде, так и в геноме. В микрочип В экспериментах это смещение можно использовать для обеспечения гибридизации нужного материала. В стабильных клеточных линиях или полностью трансгенных животных эта ошибка не наблюдается, поскольку плазмидная ДНК не восстанавливается.

Апоптоз

Апоптотические клетки разрушают свою ДНК по характерной схеме нуклеосомной лестницы. Это генерирует фрагменты ДНК, которые можно лигировать и амплифицировать во время процедуры DamID (лаборатория ван Стинселя, неопубликованные наблюдения). Влияние этих нуклеосомных фрагментов на профиль связывания белка неизвестно.

Разрешение

Разрешение DamID является функцией наличия последовательностей GATC в геноме. Белок может быть картирован только в двух последовательных сайтах GATC. Среднее расстояние между фрагментами GATC составляет 205 п.н. у Drosophila (FlyBase release 5), 260 у мышей (Mm9) и 460 у человека (HG19). Модифицированный протокол (DamIP), объединяющий иммунопреципитация m6A с вариантом Dam с менее специфичным распознаванием целевого сайта, можно использовать для получения данных с более высоким разрешением.[5]

Методы, специфичные для типов клеток

Основное преимущество DamID перед ChIP seq заключается в том, что профилирование сайтов связывания белков можно анализировать в конкретном типе клеток. in vivo без необходимости физического разделения субпопуляции клеток. Это позволяет исследовать процессы развития или физиологические процессы на животных моделях.

Целевой DamID

Целевой подход DamID (TaDa) использует феномен повторной инициации рибосом для экспрессии белков слияния Dam на достаточно низких уровнях для DamID (т.е. Dam не насыщает, что позволяет избежать токсичности). Эта конструкция может быть объединена со специфическими промоторами клеточного типа, что приводит к тканеспецифическому метилированию.[6][7] Этот подход можно использовать для анализа связывания фактора транскрипции в интересующем типе клеток или, альтернативно, dam может быть слита с Pol II субъединицы для определения связывания РНК-полимеразы и, таким образом, для определения клеточно-специфической экспрессии генов. Целевой DamID был продемонстрирован в Дрозофила и мышь[8][9] клетки.

FRT / FLP-out DamID

Клеточно-специфичный DamID также может быть получен с помощью рекомбинация опосредованное удаление транскрипционного терминатор кассета перед белком Dam-fusion.[10] Кассета терминатора фланкируется сайтами рекомбинации FRT, которые могут быть удалены в сочетании с тканеспецифической экспрессией Рекомбиназа FLP. После удаления кассеты Dam-fusion экспрессируется на низких уровнях под контролем базального промотора.

Варианты

Помимо обнаружения стандартных взаимодействий белок-ДНК, DamID может использоваться для исследования других аспектов биологии хроматина.

Сплит DamID

Этот метод можно использовать для выявления совместного связывания двух факторов с одним и тем же геномным локус. Метилаза Dam может быть экспрессирована в двух частях, которые слиты с разными представляющими интерес белками. Когда оба белка связываются с одним и тем же участком ДНК, фермент Dam восстанавливается и способен метилировать окружающие сайты GATC.[11]

Доступность хроматина

Благодаря высокой активности фермента, экспрессия непривязанного Dam приводит к метилированию всех участков доступного хроматина.[12][13] Этот подход можно использовать как альтернативу ATAC-seq или же ДНКse-seq. В сочетании со специфическими для клеточного типа методами DamID, экспрессия непривязанного Dam может использоваться для идентификации специфичных для клеточного типа промоторных или энхансерных областей.

РНК-ДНК взаимодействия

Вариант DamID, известный как RNA-DamID, может использоваться для обнаружения взаимодействий между молекулами РНК и ДНК.[14] Этот метод основан на экспрессии слитого белка Dam-MCP, который способен связываться с РНК, модифицированной с помощью MS2 стебель-петли. Связывание белка слияния Dam с РНК приводит к детектируемому метилированию в сайтах связывания РНК с геномом.

Долгосрочное регуляторное взаимодействие

Последовательности ДНК, удаленные от сайта связывания белка, могут быть физически сближены за счет образования петель хромосом. Например, такие взаимодействия опосредуют усилитель и промоутер функция. Эти взаимодействия можно обнаружить по действию метилирования Dam. Если Dam нацелен на конкретный известный локус ДНК, дистальные участки, сближенные из-за трехмерной конфигурации ДНК, также будут метилированы и могут быть обнаружены, как в обычном DamID.[15]

Одноклеточный DamID

DamID обычно выполняется примерно на 10 000 ячеек,[16] (хотя это было продемонстрировано с меньшим количеством[6]). Это означает, что полученные данные представляют собой среднее связывание или вероятность события связывания в этой популяции клеток. Протокол DamID для отдельных клеток также был разработан и применен к клеткам человека.[17] Одноклеточные подходы могут подчеркивать гетерогенность ассоциаций хроматина между клетками.

Рекомендации

  1. ^ ван Стенсель Б., Хеникофф С. (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней белков хроматина с использованием привязанной плотины метилтрансферазы». Природа Биотехнологии. 18 (4): 424–8. Дои:10.1038/74487. PMID 10748524.
  2. ^ Огхи Г. Н., Саутхолл ТД (январь 2016 г.). «Черт возьми, это хорошо! DamID-профили взаимодействия белок-ДНК». Междисциплинарные обзоры Wiley: биология развития. 5 (1): 25–37. Дои:10.1002 / wdev.205. ЧВК 4737221. PMID 26383089.
  3. ^ Ши, Ян; Он, Чуан; Aravind, L .; Сюй, Чи-Хунг; Аристизабаль-Корралес, Давид; Лю, Цзяньчжао; Сендинк, Эрдем; Гу, Лей; Бланко, Марио Андрес (07.05.2015). «Метилирование ДНК по N6-аденину у C. elegans». Клетка. 161 (4): 868–878. Дои:10.1016 / j.cell.2015.04.005. ISSN 0092-8674. ЧВК 4427530. PMID 25936839.
  4. ^ Брукс Дж. Э., Робертс Р. Дж. (Февраль 1982 г.). «Профили модификации бактериальных геномов». Исследования нуклеиновых кислот. 10 (3): 913–34. Дои:10.1093 / nar / 10.3.913. ЧВК 326211. PMID 6278441.
  5. ^ Сяо Р., Роман-Санчес Р., Мур Д. Д. (апрель 2010 г.). «DamIP: новый метод определения сайтов связывания ДНК in vivo». Сигнализация ядерного рецептора. 8: e003. Дои:10.1621 / № 08003. ЧВК 2858267. PMID 20419059.
  6. ^ а б Southall TD, Gold KS, Egger B, Davidson CM, Caygill EE, Marshall OJ, Brand AH (июль 2013 г.). «Специфическое профилирование экспрессии генов и связывания хроматина без выделения клеток: анализ занятости Pol II РНК в нервных стволовых клетках». Клетка развития. 26 (1): 101–12. Дои:10.1016 / j.devcel.2013.05.020. ЧВК 3714590. PMID 23792147.
  7. ^ Marshall OJ, Southall TD, Cheetham SW, Brand AH (сентябрь 2016 г.). «Специфичное для типа клеток профилирование взаимодействий белок-ДНК без выделения клеток с использованием целевого DamID с секвенированием следующего поколения». Протоколы природы. 11 (9): 1586–98. Дои:10.1038 / nprot.2016.084. HDL:10044/1/31094. ЧВК 7032955. PMID 27490632.
  8. ^ Тости Л., Эшмор Дж., Тан Б.С., Карбон Б, Мистри Т.К., Уилсон В., Томлинсон С.Р., Каджи К. (апрель 2018 г.). «Картирование занятости фактора транскрипции с использованием минимального количества клеток in vitro и in vivo». Геномные исследования. 28 (4): 592–605. Дои:10.1101 / gr.227124.117. ЧВК 5880248. PMID 29572359.
  9. ^ Cheetham, Seth W .; Gruhn, Wolfram H .; ван ден Амиле, Джелле; Краутц, Роберт; Саутхолл, Тони Д.; Кобаяси, Тошихиро; Сурани, М. Азим; Бренд, Андреа Х. (2018-09-05). «Целевой DamID показывает дифференциальное связывание факторов плюрипотентности млекопитающих». Разработка. 145 (20): dev.170209. Дои:10.1242 / dev.170209. ISSN 1477-9129. ЧВК 6215400. PMID 30185410.
  10. ^ Пиндюрин А.В., Паги Л., Кожевникова Е.Н., ван Аренсберген Дж., Ван Стенсель Б. (июль 2016 г.). «Индуцибельные системы DamID для геномного картирования белков хроматина у дрозофилы». Исследования нуклеиновых кислот. 44 (12): 5646–57. Дои:10.1093 / нар / gkw176. ЧВК 4937306. PMID 27001518.
  11. ^ Hass MR, Liow HH, Chen X, Sharma A, Inoue YU, Inoue T, Reeb A, Martens A, Fulbright M, Raju S, Stevens M, Boyle S, Park JS, Weirauch MT, Brent MR, Kopan R (август 2015 г.) ). «SpDamID: маркировка ДНК, связанной белковыми комплексами, позволяет идентифицировать энхансеры, реагирующие на димер Notch». Молекулярная клетка. 59 (4): 685–97. Дои:10.1016 / j.molcel.2015.07.008. ЧВК 4553207. PMID 26257285.
  12. ^ Вина DR, Talbert PB, Clark DV, Henikoff S (1996). «Введение ДНК-метилтрансферазы в Drosophila для исследования структуры хроматина in vivo». Хромосома. 104 (5): 332–40. Дои:10.1007 / BF00337221. PMID 8575244.
  13. ^ Огхи Г.Н., Эстасио Гомес А, Томсон Дж., Инь Х., Саутхолл ТД (февраль 2018 г.). «CATaDa показывает глобальное ремоделирование доступности хроматина во время дифференцировки стволовых клеток in vivo». eLife. 7. Дои:10.7554 / eLife.32341. ЧВК 5826290. PMID 29481322.
  14. ^ Cheetham SW, Brand AH (январь 2018 г.). «RNA-DamID выявляет специфическое для клеточного типа связывание roX РНК в сайтах входа в хроматин». Структурная и молекулярная биология природы. 25 (1): 109–114. Дои:10.1038 / с41594-017-0006-4. ЧВК 5813796. PMID 29323275.
  15. ^ Клеард Ф., Мошкин Ю., Карч Ф., Маэда РК (август 2006 г.). «Исследование дистанционных регуляторных взаимодействий в комплексе Drosophila melanogaster bithorax с использованием идентификации Dam». Природа Генетика. 38 (8): 931–5. Дои:10,1038 / ng1833. PMID 16823379.
  16. ^ Маршалл, Оуэн Дж .; Саутхолл, Тони Д.; Cheetham, Seth W .; Бренд, Андреа Х. (сентябрь 2016 г.). «Специфичное для типа клеток профилирование взаимодействий белок-ДНК без выделения клеток с использованием целевого DamID с секвенированием следующего поколения». Протоколы природы. 11 (9): 1586–1598. Дои:10.1038 / nprot.2016.084. HDL:10044/1/31094. ISSN 1750-2799. ЧВК 7032955. PMID 27490632.
  17. ^ Добрый, Джоп; Пейджи, Людо; де Врис, Сандра С .; Нахидиазар, Лейла; Dey, Siddharth S .; Биенко, Магда; Жан, Е; Ладжуа, Брайан; де Грааф, Кэролайн А. (24 сентября 2015 г.). «Полногеномные карты взаимодействий ядерных пластинок в отдельных клетках человека». Клетка. 163 (1): 134–147. Дои:10.1016 / j.cell.2015.08.040. ISSN 1097-4172. ЧВК 4583798. PMID 26365489.

дальнейшее чтение

внешняя ссылка