WikiDer > ДНК-след

DNA footprinting

ДНК-след представляет собой метод исследования специфичности последовательности ДНКпереплет белки in vitro. Этот метод можно использовать для изучения белок-ДНК взаимодействия как снаружи, так и внутри клеток.

Регулирование транскрипция был широко изучен, и все же многое еще не известно. Факторы транскрипции и связанные белки, которые связывают промоутеры, усилители, или же глушители управлять или подавлять транскрипцию, являются фундаментальными для понимания уникальной регуляции индивидуальной гены в пределах геном. Такие методы, как создание отпечатков ДНК, помогают выяснить, какие белки связываются с этими ассоциированными участками ДНК, и раскрыть сложности контроля транскрипции.

История

В 1978 году Дэвид Галас и Альберт Шмитц разработали метод ДНК-отпечатка стопы для изучения специфичности связывания белка-репрессора lac. Первоначально это была модификация метода химического секвенирования Максама-Гилберта.[1]

Метод

Простейшее применение этого метода - оценить, связывается ли данный белок с интересующей областью в молекуле ДНК.[2] Полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицируют и маркируют интересующую область, которая содержит потенциальный сайт связывания с белком, в идеале ампликон имеет длину от 50 до 200 пар оснований. Добавить интересующий белок к части меченой ДНК-матрицы; часть должна оставаться отдельной без белка для последующего сравнения. Добавьте агент расщепления к обеим частям матрицы ДНК. Агент расщепления представляет собой химическое вещество или фермент, который разрезает в случайных местах независимым от последовательности образом. Реакция должна происходить ровно настолько долго, чтобы каждую молекулу ДНК разрезать только в одном месте. Белок, который специфически связывает область в матрице ДНК, будет защищать ДНК, с которой он связан, от агента расщепления. Запустите оба образца рядом на полиакриламид гель-электрофорез. Часть матрицы ДНК без белка будет разрезана в случайных местах, и, таким образом, когда она будет обработана на геле, будет получено лестничное распределение. Матрица ДНК с белком приведет к лестничному распределению с разрывом в ней, «следу», где ДНК была защищена от агента расщепления. Примечание: Maxam-Gilbert chemical Секвенирование ДНК можно проводить вместе с образцами на полиакриламидном геле, чтобы можно было предсказать точное местоположение сайта связывания лиганда.

Маркировка

Матрица ДНК помечена на 3 'или 5' конце, в зависимости от расположения сайта (ов) связывания. Можно использовать следующие ярлыки: радиоактивность и флуоресценция. Радиоактивность традиционно использовалась для маркировки фрагментов ДНК для анализа отпечатков пальцев, так как этот метод был первоначально разработан на основе метода химического секвенирования Максама-Гилберта. Радиоактивная маркировка очень чувствительна и оптимальна для визуализации небольших количеств ДНК. Флуоресценция является желательным достижением из-за опасностей использования радиоактивных химикатов. Однако его было труднее оптимизировать, потому что он не всегда достаточно чувствителен для обнаружения низких концентраций целевых цепей ДНК, используемых в экспериментах по созданию отпечатков ДНК. Гели для электрофоретического секвенирования или капиллярный электрофорез успешно проанализировали след флуоресцентных меченых фрагментов.[2]

Агент расщепления

Можно выбрать множество агентов расщепления. желательным агентом является тот, который является нейтральным по отношению к последовательности, простым в использовании и легким в управлении. К сожалению, доступные агенты не соответствуют всем этим стандартам, поэтому можно выбрать подходящий агент в зависимости от вашей последовательности ДНК и интересующего лиганда. Подробно описаны следующие агенты расщепления:ДНКаза I большой белок, который функционирует как двухцепочечный эндонуклеаза. Он связывает малую бороздку ДНК и расщепляет фосфодиэфирный остов. Это хороший агент расщепления для образования следов, потому что его размер делает его физически легко затрудненным. Таким образом, более вероятно, что его действие будет заблокировано связанным белком в последовательности ДНК. Кроме того, фермент ДНКаза I легко контролируется добавлением ЭДТА для остановки реакции. Однако существуют некоторые ограничения в использовании ДНКазы I. Фермент не разрезает ДНК случайным образом; на его активность влияет местная структура и последовательность ДНК, что приводит к неровной лестнице. Это может ограничить точность прогнозирования сайта связывания белка в молекуле ДНК.[2][3]Гидроксильные радикалы созданы из Реакция Фентона, что связано с восстановлением Fe2+ с H2О2 с образованием свободных гидроксильных молекул. Эти молекулы гидроксила реагируют с основной цепью ДНК, что приводит к разрыву. Из-за их небольшого размера полученный след ДНК имеет высокое разрешение. В отличие от DNase I они не зависят от последовательности и приводят к гораздо более равномерно распределенной лестнице. Отрицательный аспект использования гидроксильных радикалов заключается в том, что они требуют больше времени из-за более медленной реакции и времени переваривания.[4]Ультрафиолетовое облучение может использоваться для возбуждения нуклеиновых кислот и создания фотореакций, приводящих к повреждению оснований в цепи ДНК. Фотореакции могут включать: разрывы одиночных цепей, взаимодействия между цепями ДНК или внутри них, реакции с растворителями или сшивки с белками. Рабочий процесс для этого метода включает дополнительный этап: после обработки защищенной и незащищенной ДНК происходит последующее удлинение праймера расщепленных продуктов. Удлинение прекратится при достижении поврежденной основы и, таким образом, когда продукты ПЦР будут проходить параллельно на геле; защищенный образец покажет дополнительную полосу, где ДНК была сшита со связанным белком. Преимущества использования УФ-излучения заключаются в том, что он очень быстро реагирует и, следовательно, может улавливать только мгновенные взаимодействия. Дополнительно может применяться к in vivo эксперименты, потому что УФ может проникать через клеточные мембраны. Недостатком является то, что гель может быть трудно интерпретировать, поскольку связанный белок не защищает ДНК, он просто изменяет фотореакции поблизости.[5]

Продвинутые приложения

В естественных условиях след

В естественных условиях Footprinting - это метод, используемый для анализа взаимодействий белок-ДНК, которые происходят в клетке в данный момент времени. ДНКаза I может быть использована в качестве расщепляющего агента, если клеточная мембрана проницаема. Однако наиболее распространенным агентом расщепления является УФ-облучение, поскольку оно проникает через клеточную мембрану, не нарушая состояния клетки, и, таким образом, может улавливать взаимодействия, чувствительные к клеточным изменениям. После того, как ДНК была расщеплена или повреждена УФ-излучением, клетки можно лизировать и очищать ДНК для анализа интересующей области. ПЦР, опосредованная лигированием, - это метод, альтернативный следу in vivo. После того, как агент расщепления был использован на геномной ДНК, что привело к разрывам одной нити, и ДНК выделена, линкер добавляется в точки разрыва. Интересующая область амплифицируется между линкером и специфичным для гена праймером, и при прохождении через полиакриламидный гель будет иметь след, на котором был связан белок.[6] В естественных условиях след в сочетании с иммунопреципитация может использоваться для оценки специфичности белка во многих частях генома. ДНК, связанная с представляющим интерес белком, может быть иммунопреципитирована антителом к ​​этому белку, а затем связывание специфической области может быть оценено с использованием метода отпечатка ДНК.[7]

Количественный след

Методика ДНК-отпечатка может быть изменена для оценки силы связывания белка с областью ДНК. Используя различные концентрации белка для эксперимента по отпечатку стопы, можно наблюдать за появлением «отпечатка» по мере увеличения концентрации и затем можно оценить сродство связывания с белками.[2]

Обнаружение капиллярным электрофорезом

Чтобы адаптировать технику отпечатков пальцев к обновленным методам обнаружения, меченые фрагменты ДНК обнаруживаются с помощью устройства для капиллярного электрофореза, а не на полиакриламидном геле. Если фрагмент ДНК, который нужно проанализировать, получают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), несложно связать флуоресцентную молекулу, такую ​​как карбоксифлуоресцеин (FAM), с праймерами. Таким образом, фрагменты, полученные в результате расщепления ДНКазой I, будут содержать FAM и будут обнаруживаться с помощью аппарата для капиллярного электрофореза. Обычно стандарты размера, меченные карбокситетраметилродамином (ROX), также добавляют к смеси фрагментов, подлежащих анализу. Таким образом были успешно идентифицированы сайты связывания факторов транскрипции.[8]

Полногеномные анализы

Секвенирование нового поколения позволил использовать общегеномный подход к выявлению следов ДНК. Открытые анализы хроматина, такие как ДНКаза-Seq[9] и FAIRE-Seq[10] доказали, что обеспечивают надежный регуляторный ландшафт для многих типов клеток.[11] Однако эти анализы требуют некоторых последующих биоинформатических анализов, чтобы получить отпечатки ДНК всего генома. Предлагаемые вычислительные инструменты можно разделить на два класса: подходы, основанные на сегментации и ориентированные на сайт.

Методы, основанные на сегментации, основаны на применении Скрытые марковские модели или методы скользящего окна для сегментации генома на открытую / закрытую область хроматина. Примеры таких методов: HINT,[12] Метод Бойля[13] и метод Нефа.[14] С другой стороны, сайт-центрические методы находят следы с учетом открытого профиля хроматина вокруг сайтов связывания, предсказанных мотивом, то есть регуляторных областей, предсказываемых с использованием информации о последовательности ДНК-белка (закодированной в таких структурах, как матрица весов позиции). Примеры этих методов: CENTIPEDE[15] и метод Куэльяра-Партиды.[16]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Галас, Д; Шмитц, А (1978). «ДНК-следы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 5 (9): 3157–70. Дои:10.1093 / nar / 5.9.3157. ЧВК 342238. PMID 212715.
  2. ^ а б c d Хэмпшир, А; Rusling, D; Бротон-Хед, V; Фокс, К. (2007). «Footprinting: метод определения селективности последовательности, аффинности и кинетики ДНК-связывающих лигандов». Методы. 42 (2): 128–140. Дои:10.1016 / j.ymeth.2007.01.002. PMID 17472895.
  3. ^ ЛеБлан Б. и Мосс Т. (2001) ДНКазы I Footprinting. Методы молекулярной биологии. 148: 31–8.
  4. ^ Зайчиков Э., Шикор П., Денисова Л. и Хойманн Х. (2001) Следы гидроксильных радикалов. Методы молекулярной биологии. 148: 49–61.
  5. ^ Гейзельманн Дж. И Боккард Ф. (2001) Ультрафиолетовый лазерный отпечаток. Методы молекулярной биологии. 148: 161-73.
  6. ^ Dai S, Chen H, Chang C, Riggs A, Flanagan S. (2000) ПЦР, опосредованная лигированием, для количественного анализа отпечатков пальцев in vivo. Природа Биотехнологии. 18: 1108–1111.
  7. ^ Зарет, К. (1997). «Редакция». Методы. 11 (2): 149–150. Дои:10.1006 / мет.1996.0400. PMID 8993026.
  8. ^ Ковач, Кристиан А .; Штейнманн, Мириам; Magistretti, Pierre J .; Халфон, Оливье; Кардино, Жан-Рене (2006). «C / EBPβ связывает передачу сигналов дофамина с экспрессией гена-предшественника вещества P в нейронах полосатого тела». Журнал нейрохимии. 98 (5): 1390–1399. Дои:10.1111 / j.1471-4159.2006.03957.x. PMID 16771829.
  9. ^ Песня, L; Кроуфорд, GE (февраль 2010 г.). «DNase-seq: метод высокого разрешения для картирования активных регуляторных элементов гена в геноме из клеток млекопитающих». Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2010 (2): pdb.prot5384 +. Дои:10.1101 / pdb.prot5384. ЧВК 3627383. PMID 20150147.
  10. ^ Giresi, PG; Kim, J; McDaniell, RM; Айер, ВР; Либ, JD (июнь 2007 г.). «FAIRE (Изоляция регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека». Геномные исследования. 17 (6): 877–85. Дои:10.1101 / гр.5533506. ЧВК 1891346. PMID 17179217.
  11. ^ Турман RE; и другие. (Сентябрь 2012 г.). «Доступный хроматиновый ландшафт генома человека». Природа. 489 (7414): 75–82. Bibcode:2012Натура 489 ... 75 т. Дои:10.1038 / природа11232. ЧВК 3721348. PMID 22955617.
  12. ^ Gusmao, EG; Дитрих, К; Зенке, М; Коста, IG (август 2014 г.). «Обнаружение активных сайтов связывания фактора транскрипции с комбинацией гиперчувствительности к ДНКазе и модификаций гистонов». Биоинформатика. 30 (22): 3143–51. Дои:10.1093 / биоинформатика / btu519. PMID 25086003.
  13. ^ Бойл, AP; и другие. (Март 2011 г.). «Всегеномный анализ in vivo с высоким разрешением различных факторов транскрипции в клетках человека». Геномные исследования. 21 (3): 456–464. Дои:10.1101 / гр.112656.110. ЧВК 3044859. PMID 21106903.
  14. ^ Неф, S; и другие. (Сентябрь 2012 г.). «Обширный нормативный лексикон человека, закодированный в следах факторов транскрипции». Природа. 489 (7414): 83–90. Bibcode:2012Натура.489 ... 83Н. Дои:10.1038 / природа11212. ЧВК 3736582. PMID 22955618.
  15. ^ Pique-Regi, R; и другие. (Март 2011 г.). «Точный вывод о связывании фактора транскрипции на основании данных о последовательности ДНК и доступности хроматина». Геномные исследования. 21 (3): 447–455. Дои:10.1101 / гр.112623.110. ЧВК 3044858. PMID 21106904.
  16. ^ Куэльяр-Партида, G; и другие. (Январь 2012 г.). «Эпигенетические приоры для идентификации сайтов связывания активных транскрипционных факторов». Биоинформатика. 28 (1): 56–62. Дои:10.1093 / биоинформатика / btr614. ЧВК 3244768. PMID 22072382.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
ДНК-след