WikiDer > Редактирование эпигенома

Визуальный обзор того, как белки TALE используются для редактирования эпигенома.

Редактирование эпигенома или же Эпигеномная инженерия это тип генной инженерии, в котором эпигеном модифицируется в определенных сайтах с использованием сконструированных молекул, нацеленных на эти сайты (в отличие от полногеномных модификаций). В то время как редактирование генов включает изменение самой фактической последовательности ДНК, эпигенетическое редактирование включает в себя изменение и представление последовательностей ДНК белкам и другим факторам связывания ДНК, которые влияют на функцию ДНК. «Редактируя» эпигеномные признаки таким образом, исследователи могут определить точную биологическую роль эпигенетической модификации в рассматриваемом участке.

Сконструированные белки, используемые для редактирования эпигенома, состоят из связывающего ДНК домена, нацеленного на определенные последовательности, и эффекторного домена, который изменяет эпигеномные характеристики. В настоящее время для редактирования эпигенома преимущественно используются три основные группы ДНК-связывающих белков: Цинковый палец белки, Эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALEs) и нуклеазо-дефицитные слияния Cas9 (CRISPR).

Общая концепция

Сравнение всего генома эпигенетический карты с экспрессия гена позволил исследователям назначить активирующую или подавляющую роль конкретным модификациям. Важность последовательности ДНК в регуляции эпигенома была продемонстрирована с использованием мотивов ДНК для прогнозирования эпигеномной модификации.^[1] Дальнейшее понимание механизмов, лежащих в основе эпигенетика пришли из in vitro биохимические и структурные анализы. С помощью модельные организмыисследователи смогли описать роль многих хроматин факторы через нокаутировать исследования. Однако отключение всего модификатора хроматина оказывает огромное влияние на весь геном, что может не точно отражать его функцию в конкретном контексте. Как один из примеров этого, Метилирование ДНК происходит в повторяющиеся регионы, промоутеры, усилители, и ген тела. Несмотря на то что Метилирование ДНК на промоторах генов обычно коррелирует с репрессией генов, метилирование тел генов коррелирует с активацией гена, а метилирование ДНК также может играть роль в сплайсинге генов.^[2] Возможность прямого нацеливания и редактирования отдельных сайтов метилирования имеет решающее значение для определения точной функции метилирования ДНК в конкретном сайте. Редактирование эпигенома - мощный инструмент, позволяющий проводить такой анализ. Для сайт-специфичного редактирования метилирования ДНК, а также для редактирования гистонов, системы редактирования генома были адаптированы в системы редактирования эпигена. Короче говоря, геномные хоминговые белки с инженерными или природными функциями нуклеаз для редактирования генов могут быть мутированы и адаптированы в чисто системы доставки. Эпигенетический модифицирующий фермент или домен может быть слит с хоминг-белком, и местные эпигенетические модификации могут быть изменены при привлечении белка.

Нацеливание на белки

СКАЗКА

В Эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE) белок распознает определенные последовательности ДНК на основе состава его ДНК-связывающий домен.^[3] Это позволяет исследователю конструировать различные белки TALE для распознавания целевой последовательности ДНК путем редактирования первичной структуры белка TALE. Специфичность связывания этого белка обычно подтверждается с использованием Иммунопреципитация хроматина (ЧИП) и Секвенирование по Сэнгеру полученного фрагмента ДНК.^[4][5][6] Это подтверждение по-прежнему требуется во всех исследованиях распознавания последовательностей TALE.^[7]При использовании для редактирования эпигенома эти связывающие ДНК белки присоединяются к эффекторному белку. Эффекторные белки, которые использовались для этой цели, включают: Ten-eleven транслокация метилцитозиндиоксигеназа 1 (TET1),^[5] Лизин (K) -специфическая деметилаза 1A (LSD1)^[6] и Кальций и интегрин-связывающий белок 1 (CIB1).^[4]

Белки цинковых пальцев

Использование цинковый палец-fusion белки для распознавания сайтов для редактирования эпигенома также были исследованы. Maeder et al. сконструировал белок ZF-TET1 для использования в деметилировании ДНК.^[5] Эти белки с цинковыми пальцами работают аналогично СКАЗКА белки в том, что они способны связываться со специфическими участками последовательности ДНК на основе их белковой структуры, которая может быть модифицирована. Chen et al. успешно использовали ДНК-связывающий домен цинкового пальца в сочетании с TET1 белок, чтобы вызвать деметилирование нескольких ранее заглушенных генов.^[8]

CRISPR-Cas

В Кластерный регуляторный короткий палиндромный повтор с промежутками (CRISPR)-Cas-система функционирует как сайт-специфичная нуклеаза ДНК.^[9] В хорошо изученной системе CRISPR типа II нуклеаза Cas9 связывается с химерой, состоящей из tracRNA и crRNA. Эту химеру часто называют направляющей РНК (гРНК). Когда белок Cas9 связывается с гРНК, специфичной для области ДНК, Cas9 расщепляет ДНК по целевым локусам ДНК. Однако когда вводятся точечные мутации D10A и H840A, образуется каталитически мертвый Cas9 (dCas9), который может связывать ДНК, но не расщепляется.^[10] Система dCas9 была использована для целенаправленного эпигенетического репрограммирования с целью введения сайт-специфичного метилирования ДНК. Путем объединения DNMT3a каталитический домен с белком dCas9, dCas9-DNMT3a способен достигать целевого метилирования ДНК целевой области, как указано в настоящем руководстве по РНК.^[11] Точно так же dCas9 был слит с каталитическим ядром ацетилтрансферазы человека. p300. dCas9-p300 успешно катализирует целевое ацетилирование гистона H3 лизина 27.^[12]

Вариант редактирования эпигенома CRISPR (называемый FIRE-Cas9) позволяет отменить внесенные изменения, если что-то пошло не так.^[13][14]

Обычно используемые эффекторные белки

TET1 вызывает деметилирование цитозина в CpG сайты. Этот белок был использован для активации генов, которые подавляются метилированием CpG, и для определения роли отдельных сайтов метилирования CpG.^[5] LSD1 вызывает деметилирование H3K4me1/ 2, что также вызывает косвенный эффект деацетилирования на H3K27. Этот эффектор можно использовать на гистоны в энхансерных областях, что может изменять экспрессию соседних генов.^[6] CIB1 светочувствительный криптохром, этот криптохром слит с белком TALE. Второй белок содержит партнера по взаимодействию (CRY2) слился с хроматин/ Модификатор ДНК (напр. SID4X). CRY2 может взаимодействовать с CIB1 когда криптохром был активирован подсветкой синим светом.^[15] Взаимодействие позволяет модификатору хроматина действовать в желаемом месте. Это означает, что модификация может выполняться индуцируемым и обратимым образом, что снижает долгосрочные вторичные эффекты, которые могут быть вызваны конститутивной эпигенетической модификацией.^[4]

Приложения

Изучение функции и активности энхансеров

Редактирование участков энхансера генов в геноме посредством целенаправленной эпигенетической модификации было продемонстрировано Mendenhall et al. (2013).^[6] В этом исследовании использовался эффекторный слитый белок TALE-LSD1 для нацеливания на энхансеры генов, чтобы вызвать молчание энхансера, чтобы вывести активность энхансера и контроль генов. Нацеливание на конкретные энхансеры, за которыми следует локус ОТ-КПЦР позволяет определить гены, на которые влияет заглушенный энхансер. Альтернативно, индукция сайленсинга энхансера в областях выше генов позволяет изменять экспрессию генов. ОТ-КПЦР затем можно использовать для изучения влияния этого на экспрессию генов. Это позволяет детально изучить функцию и активность энхансеров.^[6]

Определение функции конкретных сайтов метилирования

Важно понимать роль, которую специфические сайты метилирования играют в регуляции экспрессии генов. Чтобы изучить это, одна исследовательская группа использовала слитый белок TALE-TET1 для деметилирования одного сайта метилирования CpG.^[5] Хотя этот подход требует множества средств контроля для обеспечения специфического связывания с целевыми локусами, правильно проведенное исследование с использованием этого подхода может определить биологическую функцию конкретного сайта метилирования CpG.^[5]

Непосредственное определение роли эпигенетических модификаций

Эпигенетическое редактирование с использованием индуцибельного механизма предлагает широкий спектр возможностей для изучения эпигенетических эффектов в различных состояниях. Одна исследовательская группа наняла оптогенетический двухгибридная система, в которой интегрирован специфичный для последовательности ДНК-связывающий домен TALE со светочувствительным белком криптохрома 2 (CIB1).^[4] После экспрессии в клетках система смогла индуцировать модификации гистонов и определить их функцию в конкретном контексте.^[4]

Ограничения

Специфичность последовательности критически важна при редактировании эпигенома и должна быть тщательно проверена (это можно сделать с помощью иммунопреципитация хроматина с последующим Секвенирование по Сэнгеру для проверки целевой последовательности).^[7] Неизвестно, может ли слияние TALE оказывать влияние на каталитическую активность модификатора эпигенома. Это может быть особенно важно для эффекторных белков, которые требуют нескольких субъединиц и комплексов, таких как Поликомб репрессивный комплекс.^[7] Белки, используемые для редактирования эпигенома, могут блокировать лиганды и субстраты в целевом сайте.^[7] Сам белок TALE может даже конкурировать с факторы транскрипции если они нацелены на одну и ту же последовательность.^[7] Кроме того, системы репарации ДНК могут обратить вспять изменения хроматина и предотвратить внесение желаемых изменений.^[7] Следовательно, необходимо оптимизировать конструкции слияния и механизмы нацеливания для надежного и воспроизводимого редактирования эпигенома.

Ссылки для дальнейшего чтения

• Srivastava, D .; ДеВитт, Н. (2016). «Перепрограммирование клеток in vivo: новое поколение». Клетка. 166 (6): 1386–1396. Дои:10.1016 / j.cell.2016.08.055. ЧВК 6234007. PMID 27610565.
• Чакраборти, С .; Ji, H .; Кабади, А. М .; Gersbach, C.A .; Christoforou, N .; Леонг, К. В. (2014). «Система на основе CRISPR / Cas9 для перепрограммирования спецификации клеточного клона». Отчеты о стволовых клетках. 3 (6): 940–947. Дои:10.1016 / j.stemcr.2014.09.013. ЧВК 4264059. PMID 25448066.
• Thakore, P. I .; Black, J. B .; Hilton, I.B .; Герсбах, К. А. (2016). «Редактирование эпигенома: технологии программируемой транскрипции и эпигенетической модуляции». Методы природы. 13 (2): 127–137. Дои:10,1038 / нмEth.3733. ЧВК 4922638. PMID 26820547.
• Vora, S .; Tuttle, M .; Cheng, J .; Чёрч, Г. (2016). «Следующая остановка революции CRISPR: эпигенетические регуляторы, управляемые РНК». Журнал FEBS. 283 (17): 3181–3193. Дои:10.1111 / фев.13768. PMID 27248712.
• Nelson, C.E .; Герсбах, К. А. (2016). «Инженерные средства доставки для редактирования генома». Ежегодный обзор химической и биомолекулярной инженерии. 7: 637–662. Дои:10.1146 / annurev-chembioeng-080615-034711. PMID 27146557.
• Hilton, I.B .; D'Ippolito, A.M .; Vockley, C.M .; Thakore, P. I .; Crawford, G.E .; Reddy, T. E .; Герсбах, К. А. (2015). «Редактирование эпигенома ацетилтрансферазой на основе CRISPR-Cas9 активирует гены промоторов и энхансеров». Природа Биотехнологии. 33 (5): 510–517. Дои:10.1038 / nbt.3199. ЧВК 4430400. PMID 25849900.
• McDonald, J. I .; Celik, H .; Rois, L.E .; Fishberger, G .; Fowler, T .; Rees, R .; Челлен, Г. А. (2016). «Перепрограммируемая система на основе CRISPR / Cas9 для индукции сайт-специфического метилирования ДНК». Биология Открыть. 5 (6): 866–874. Дои:10.1242 / bio.019067. ЧВК 4920199. PMID 27170255.
• Сюй, X .; Tao, Y .; Gao, X .; Zhang, L .; Li, X .; Zou, W .; Ху Р. (2016). «Подход на основе CRISPR для целенаправленного деметилирования ДНК». Cell Discovery. 2: 16009. Дои:10.1038 / celldisc.2016.9. ЧВК 4853773. PMID 27462456.
• Zalatan, J. G .; Ли, М. Э .; Almeida, R .; Гилберт, Л. А .; Whitehead, E.H .; Ла Русса, М .; Лим, В. А. (2015). «Разработка сложных синтетических транскрипционных программ с каркасами CRISPR РНК». Клетка. 160 (1): 339–350. Дои:10.1016 / j.cell.2014.11.052. ЧВК 4297522. PMID 25533786.
• Morita, S .; Noguchi, H .; Horii, T .; Накабаяси, К .; Kimura, M .; Окамура, К .; Хатада, И. (2016). «Нацеленное деметилирование ДНК in vivo с использованием dCas9-пептидного повтора и слияния каталитического домена scFv-TET1». Природа Биотехнологии. 34 (10): 1060–1065. Дои:10.1038 / nbt.3658. PMID 27571369.
• Лю, X. S .; Wu, H .; Ji, X .; Stelzer, Y .; Wu, X .; Czauderna, S .; Яениш, Р. (2016). «Редактирование метилирования ДНК в геноме млекопитающих». Клетка. 167 (1): 233–247. Дои:10.1016 / j.cell.2016.08.056. ЧВК 5062609. PMID 27662091.
• Amabile, A .; Migliara, A .; Capasso, P .; Biffi, M .; Cittaro, D .; Naldini, L .; Ломбардо, А. (2016). «Унаследованное замалчивание эндогенных генов с помощью целевого эпигенетического редактирования методом Hit-and-Run». Клетка. 167 (1): 219–232. Дои:10.1016 / j.cell.2016.09.006. ЧВК 5039111. PMID 27662090.
• Tompkins JD. www.epigenomeengineering.com
• Активация CRISPR отдельных генов превращает клетки кожи в стволовые клетки
• Liao, H.K .; Hatanaka, F .; Araoka, T .; Reddy, P .; Wu, M. Z .; Sui, Y .; Esteban, C.R .; Изписуа Бельмонте, J.C. (2017). «Активация гена-мишени in vivo с помощью CRISPR / Cas9-опосредованной трансэпигенетической модуляции». Клетка. 171 (7): 1495–1507. Дои:10.1016 / j.cell.2017.10.025. ЧВК 5732045. PMID 29224783.
• Lau, C.H .; Сух, Ю. (2018). «Редактирование эпигенома in vivo и модуляция транскрипции с использованием технологии CRISPR». Трансгенные исследования. 27 (6): 489–509. Дои:10.1007 / s11248-018-0096-8. ЧВК 6261694. PMID 30284145.

Рекомендации