WikiDer > HaloTag

HaloTag
Кодирующая область белка HaloTag может быть вставлена ​​рядом с интересующим геном. Ген устойчивости к ампициллину также вставлен с целью очистки.

HaloTag представляет собой метку белка с собственной меткой. Это пептид из 297 остатков (33 кДа), полученный из бактериального фермент, разработанный для ковалентного связывания с синтетическим лигандом. Бактериальный фермент может быть слит с различными интересующими белками.[1] Синтетический лиганд выбирают из ряда доступных лигандов в соответствии с типом экспериментов, которые необходимо провести. Этот бактериальный фермент представляет собой галогеналкандегалогеназа, который действует как гидролаза и предназначен для облегчения визуализации внутриклеточной локализации интересующего белка, иммобилизации интересующего белка или захвата партнеров по связыванию интересующего белка в его биохимической среде.[2] HaloTag состоит из двух ковалентно связанных сегментов, включая галогеналкандегалогеназу и синтетический лиганд выбора. Эти синтетические лиганды состоят из реакционноспособного хлоралканового линкера, связанного с функциональной группой.[3] Функциональные группы могут быть либо биотином (может использоваться как аффинная метка), либо их можно выбрать из пяти доступных флуоресцентных красителей, включая кумарин, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM и TMR. Эти флуоресцентные красители можно использовать для визуализации живых или химически закрепленных клеток.[4]

Механизм

Пять доступных флуоресцентных красителей, которые могут связываться с реактивным линкером. Кроме того, можно визуализировать концевой хлор реактивного хлоралкана.

HaloTag - это гидролаза, которая имеет генетически модифицированный активный сайт, который специфически связывает реактивный хлоралкановый линкер и имеет повышенную скорость связывания лиганда.[5] Реакция, которая формирует связь между белковой меткой и хлоралкановым линкером, является быстрой и по существу необратимой в физиологических условиях из-за концевого хлора линкерной части.[6] В вышеупомянутой реакции нуклеофильная атака реагирующего с хлоралканом линкера вызывает замещение галогена аминокислотным остатком, что приводит к образованию ковалентного промежуточного соединения алкил-фермента. Этот промежуточный продукт затем будет гидролизоваться аминокислотным остатком в гидролазе дикого типа.[7] Это привело бы к регенерации фермента после реакции. Однако в модифицированной галогеналкандегалогеназе (HaloTag) промежуточный продукт реакции не может проходить через последующую реакцию, потому что он не может быть гидролизован из-за мутации фермента. Это приводит к тому, что промежуточное соединение сохраняется в виде стабильного ковалентного аддукта, с которым нет связанной обратной реакции.[8]

Использует

Различные части гибридного белка. Как показано на рисунке, белок HaloTag состоит из синтетического лиганда и частей реактивного хлоралканового линкера. Белок HaloTag прикреплен к интересующему белку.

HaloTagged слитые белки можно выразить с помощью стандартных рекомбинантный белок техники выражения.[9] Кроме того, есть несколько коммерческих векторов доступны, которые просто требуют вставки интересующего гена. [10] Поскольку бактериальные дегалогеназы относительно малы, а реакции, описанные выше, чужды клеткам млекопитающих, эндогенные метаболические реакции млекопитающих не вмешиваются.[11] После того, как слитый белок экспрессируется, появляется широкий спектр потенциальных областей для экспериментов, включая ферментативные анализы, визуализацию клеток, белковые массивы, определение субклеточной локализации и многие дополнительные возможности.[12]

Смотрите также


Рекомендации

  1. ^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C и др. (Июнь 2008 г.). «HaloTag: новая технология маркировки белков для визуализации клеток и анализа белков». ACS Химическая биология. 3 (6): 373–82. Дои:10.1021 / cb800025k. PMID 18533659.
  2. ^ Гипманс Б.Н., Адамс С.Р., Эллисман М.Х., Цзянь Р.Ю. (апрель 2006 г.). «Флуоресцентный набор инструментов для оценки местоположения и функции белков». Наука. 312 (5771): 217–24. Bibcode:2006Научный ... 312..217G. Дои:10.1126 / science.1124618. PMID 16614209.
  3. ^ Когуре Т., Карасава С., Араки Т., Сайто К., Киндзё М., Мияваки А. (май 2006 г.). «Флуоресцентный вариант белка из каменистого коралла Montipora позволяет использовать двухцветную одноцветную флуоресцентную кросс-корреляционную спектроскопию». Природа Биотехнологии. 24 (5): 577–81. Дои:10.1038 / nbt1207. PMID 16648840.
  4. ^ Миллер Л.В., корнуоллский VW (февраль 2005 г.). «Селективное химическое мечение белков в живых клетках». Современное мнение в области химической биологии. 9 (1): 56–61. Дои:10.1016 / j.cbpa.2004.12.007. PMID 15701454.
  5. ^ Прис Ф., Кингма Дж., Кроошоф Г. Х., Джеронимус-Стратинг К. М., Брюинз А. П., Янссен Д. Б. (май 1995 г.). «Гистидин 289 необходим для гидролиза промежуточного алкильного фермента галогеналкандегалогеназы». Журнал биологической химии. 270 (18): 10405–11. Дои:10.1074 / jbc.270.18.10405. PMID 7737973.
  6. ^ Во DS (июнь 2005 г.). "Максимальное использование тегов по интересам". Тенденции в биотехнологии. 23 (6): 316–20. Дои:10.1016 / j.tibtech.2005.03.012. PMID 15922084.
  7. ^ Чен И., Тинг А.Ю. (февраль 2005 г.). «Сайт-специфическая маркировка белков небольшими молекулами в живых клетках». Текущее мнение в области биотехнологии. 16 (1): 35–40. Дои:10.1016 / j.copbio.2004.12.003. PMID 15722013.
  8. ^ Маркс К.М., Нолан Г.П. (август 2006 г.). «Стратегии химической маркировки для клеточной биологии». Методы природы. 3 (8): 591–6. Дои:10.1038 / nmeth906. PMID 16862131.
  9. ^ Адамс С.Р., Кэмпбелл Р.Э., Гросс Л.А., Мартин Б.Р., Уолкап Г.К., Яо Й. и др. (Май 2002 г.). «Новые биомышьяковые лиганды и тетрацистеиновые мотивы для мечения белков in vitro и in vivo: синтез и биологические применения». Журнал Американского химического общества. 124 (21): 6063–76. Дои:10.1021 / ja017687n. PMID 12022841.
  10. ^ "Векторы HaloTag на Промеге". Получено 9 февраля 2017.
  11. ^ Наестед Х, Феннема М., Хао Л., Андерсен М., Янссен Д. Б., Манди Дж. (Июнь 1999 г.). «Бактериальный ген галоалкандегалогеназы в качестве отрицательного селектируемого маркера у Arabidopsis» (PDF). Журнал растений. 18 (5): 571–6. Дои:10.1046 / j.1365-313x.1999.00477.x. PMID 10417708.
  12. ^ Janssen DB (апрель 2004 г.). «Развивающиеся галогеналкановые дегалогеназы». Современное мнение в области химической биологии. 8 (2): 150–9. Дои:10.1016 / j.cbpa.2004.02.012. PMID 15062775.