WikiDer > Репортерный ген

Reporter gene
Схема, показывающая, как репортерный ген используется для изучения регуляторной последовательности.

В молекулярная биология, а репортерный ген (часто просто репортер) это ген что исследователи придают регуляторная последовательность другого интересующего гена бактерии, культура клеток, животные или растения. Такие гены называют репортерами, потому что характеристики, которые они придают экспрессирующим их организмам, легко идентифицировать и измерить, или потому что они выбираемые маркеры. Репортерные гены часто используются в качестве индикатора того, был ли определенный ген поглощен или экспрессирован в популяции клеток или организма.

Общие репортерные гены

Чтобы ввести репортерный ген в организм, ученые помещают репортерный ген и интересующий ген в один и тот же Конструкция ДНК быть вставленным в клетку или организм. За бактерии или же прокариотические клетки в культуре это обычно в форме кольцевой молекулы ДНК, называемой плазмида. Важно использовать репортерный ген, который изначально не экспрессируется в исследуемой клетке или организме, поскольку экспрессия репортера используется как маркер для успешного поглощения интересующего гена.[1]

Обычно используемые репортерные гены, которые вызывают визуально идентифицируемые характеристики, обычно включают: флуоресцентный и люминесцентный белки. Примеры включают ген, который кодирует медузу. зеленый флуоресцентный белок (GFP), что вызывает клетки которые выражают его светиться зеленым в синем свете, фермент люцифераза, который катализирует реакцию с люциферин производить свет, а красный флуоресцентный белок из гена dsRed [fr].[2][3][4][5][6] В GUS ген обычно используется в растениях, но люцифераза и GFP становятся все более распространенными.[7][8]

Обычным репортером у бактерий является Кишечная палочка lacZ ген, кодирующий белок бета-галактозидаза.[9] Этот фермент заставляет бактерии, экспрессирующие ген, казаться синими при выращивании на среде, содержащей аналог субстрата. X-gal. Примером селектируемого маркера, который также является репортером у бактерий, является хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT) ген, придающий устойчивость к антибиотику хлорамфеникол.[10]

Имя генаГенный продуктАнализRef.
lacZβ-галактозидазаФерментный анализ, гистохимический[9]
КотХлорамфениколацетилтрансферазаХлорамфеникол ацетилирование[10]
gfpЗеленый флуоресцентный белокФлуоресцентный[2]
rfpКрасный флуоресцентный белокМикроскопический, Спектрофотометрия[11]
люкФермент люциферазаБиолюминесценция[3]

Анализы трансформации и трансфекции

Многие методы трансфекция и трансформация - два способа экспрессии чужеродного или модифицированного гена в организме - эффективны только для небольшого процента населения, подвергающегося этим методам.[12][13] Таким образом, необходим метод идентификации этих нескольких успешных событий поглощения гена. Репортерные гены, используемые таким образом, обычно экспрессируются самостоятельно. промоутер (Участки ДНК, которые инициируют транскрипцию гена) независимо от представленного интересующего гена; репортерный ген может быть экспрессирован конститутивно (то есть "всегда включен") или индуцируемым внешним вмешательством, таким как введение Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в системе β-галактозидазы.[9] В результате экспрессия репортерного гена не зависит от экспрессии интересующего гена, что является преимуществом, когда интересующий ген экспрессируется только при определенных условиях или в тканях, к которым трудно получить доступ.[1]

В случае репортеров селективных маркеров, таких как CAT, трансфицированная популяция бактерий может быть выращена на субстрате, который содержит хлорамфеникол. Только те клетки, которые успешно восприняли конструкцию, содержащую ген CAT, выживут и будут размножаться в этих условиях.[10]

Анализы экспрессии генов

Репортерные гены можно использовать для анализа экспрессии интересующего гена, который обычно трудно оценить количественно.[1] Гены-репортеры могут продуцировать белок, который не оказывает очевидного или немедленного воздействия на культуру клеток или организм. В идеале они не присутствуют в природном геноме, чтобы можно было выделить экспрессию репортерного гена в результате экспрессии интересующего гена.[1][14]

Чтобы активировать репортерные гены, их можно экспрессировать конститутивно, где они непосредственно прикреплены к интересующему гену для создания слияние генов.[15] Этот метод является примером использования СНГ-игра актеров элементы, где два гена находятся под одними и теми же элементами промотора и записано в один информационная РНК молекула. В мРНК затем переведено в белок. Важно, чтобы оба белка могли правильно складывать в их активные конформации и взаимодействуют со своими субстратами, несмотря на слияние. При создании конструкции ДНК обычно включается сегмент ДНК, кодирующий гибкую полипептидную линкерную область, так что репортер и генный продукт будут лишь минимально мешать друг другу.[16][17] Репортерные гены также могут быть экспрессированы индукция во время роста. В этих случаях, транс-игра актеров элементы, такие как факторы транскрипции используются для экспрессии репортерного гена.[18][19]

Анализ репортерного гена все чаще используется в грохочение с высокой пропускной способностью (HTS) для идентификации низкомолекулярных ингибиторов и активаторов белковых мишеней и путей открытие лекарств и химическая биология. Поскольку сами репортерные ферменты (например, светлячки люцифераза) могут быть непосредственными мишенями малых молекул и затруднять интерпретацию данных HTS, были разработаны новые конструкции репортеров совпадений, включающие подавление артефактов.[20][21]

Промоторные анализы

Репортерные гены можно использовать для анализа активности конкретного промотора в клетке или организме.[22] В этом случае нет отдельного «интересующего гена»; репортерный ген просто помещается под контроль целевого промотора, и активность продукта репортерного гена измеряется количественно. Результаты обычно сообщаются относительно активности под «консенсусным» промотором, который, как известно, индуцирует сильную экспрессию гена.[23]

Дальнейшее использование

Более сложное использование репортерных генов в больших масштабах находится в двухгибридный скрининг, который направлен на идентификацию белков, которые изначально взаимодействуют друг с другом in vivo.[24]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c d Дебнат, Мусуми; Прасад, Годаварти Б.К.С.; Бисен, Пракаш С. (2010), Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти Б.К.С.; Бисен, Пракаш С. (ред.), «Репортер Джин», Молекулярная диагностика: перспективы и возможности, Springer, Нидерланды, стр. 71–84, Дои:10.1007/978-90-481-3261-4_5, ISBN 978-90-481-3261-4
  2. ^ а б Соболески, Марк Р .; Оукс, Джейсон; Хэлфорд, Уильям П. (март 2005 г.). «Зеленый флуоресцентный белок является количественным репортером экспрессии генов в отдельных эукариотических клетках». Журнал FASEB. 19 (3): 440–442. Дои:10.1096 / fj.04-3180fje. ISSN 0892-6638. ЧВК 1242169. PMID 15640280.
  3. ^ а б Смейл, С. Т. (01.05.2010). «Люциферазный анализ». Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2010 (5): pdb.prot5421. Дои:10.1101 / pdb.prot5421. ISSN 1559-6095. PMID 20439408.
  4. ^ Ях, Гвидо; Бино, Эльке; Фрингс, Сабина; Люкса, Керстин; Шелл, Джефф (2001). «Использование красного флуоресцентного белка из Discosoma sp. (DsRED) в качестве репортера для экспрессии генов растений». Журнал растений. 28 (4): 483–491. Дои:10.1046 / j.1365-313X.2001.01153.x. ISSN 1365-313X. PMID 11737785.
  5. ^ Чжан, Цисян; Walawage, Sriema L .; Триколи, Дэвид М .; Dandekar, Abhaya M .; Лесли, Чарльз А. (май 2015 г.). «Красный флуоресцентный белок (DsRED) от Discosoma sp. Как репортер экспрессии генов в соматических зародышах грецкого ореха». Отчеты о растительных клетках. 34 (5): 861–869. Дои:10.1007 / s00299-015-1749-1. ISSN 1432-203X. PMID 25627255. S2CID 9184712.
  6. ^ Миккельсен, Лизбет; Саррокко, Сабрина; Любек, Метте; Дженсен, Дэн Функ (01.06.2003). «Экспрессия красного флуоресцентного белка DsRed-Express в мицелиальных грибах аскомицетов». Письма о микробиологии FEMS. 223 (1): 135–139. Дои:10.1016 / S0378-1097 (03) 00355-0. ISSN 0378-1097. PMID 12799012.
  7. ^ Халл, Джиллиан А .; Девич, Мартин (1995), Джонс, Хеддвин (редактор), "Система репортерных генов β-глюкуронидазы (gus)", Протоколы переноса и экспрессии генов растений, Методы молекулярной биологии ™, Springer New York, 49, стр. 125–141, Дои:10.1385 / 0-89603-321-х: 125, ISBN 978-1-59259-536-5, PMID 8563799
  8. ^ Ку, Дж .; Kim, Y .; Kim, J .; Yeom, M .; Lee, I.C .; Нам, Х. Г. (2007). "Репортер слияния GUS / люциферазы для улавливания растительных генов и для анализа активности промотора с люциферин-зависимым контролем стабильности репортерного белка". Физиология растений и клеток. 48 (8): 1121–1131. Дои:10.1093 / pcp / pcm081. PMID 17597079.
  9. ^ а б c Смейл, С. Т. (01.05.2010). «-Галактозидазный анализ». Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2010 (5): pdb.prot5423. Дои:10.1101 / pdb.prot5423. ISSN 1559-6095. PMID 20439410.
  10. ^ а б c Смейл, С. Т. (01.05.2010). «Анализ ацетилтрансферазы хлорамфеникола». Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2010 (5): pdb.prot5422. Дои:10.1101 / pdb.prot5422. ISSN 1559-6095. PMID 20439409.
  11. ^ Nordgren, I.K .; Тавассоли, А (2014). «Двунаправленная флуоресцентная двухгибридная система для мониторинга белок-белковых взаимодействий». Молекулярные биосистемы. 10 (3): 485–90. Дои:10.1039 / c3mb70438f. PMID 24382456.
  12. ^ Ханахан, Дуглас; Джесси, Джоэл; Блум, Фредрик Р. (1991-01-01), «[4] Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий», Методы в энзимологии, Бактериальные генетические системы, Academic Press, 204: 63–113, Дои:10.1016 / 0076-6879 (91) 04006-а, ISBN 9780121821050, PMID 1943786
  13. ^ Ханахан, Дуглас (1983-06-05). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии. 166 (4): 557–580. Дои:10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8. ISSN 0022-2836. PMID 6345791.
  14. ^ Promega Corporation, Promega Corporation (22 октября 2014 г.). «Введение в анализы репортерных генов». YouTube. Получено Двадцать первое марта, 2020.
  15. ^ де Йонг, Хидде; Гейзельманн, Йоханнес (2015). Малер, Одед; Халас, Адам; Данг, Тао; Пьяцца, Карла (ред.). «Флуоресцентные репортерные гены и анализ бактериальных регуляторных сетей». Гибридная системная биология. Конспект лекций по информатике. Издательство Springer International. 7699: 27–50. Дои:10.1007/978-3-319-27656-4_2. ISBN 978-3-319-27656-4.
  16. ^ Спектор, Дэвид Л .; Голдман, Роберт Д. (01.12.2006). «Создание и экспрессия слитых белков GFP». Протоколы CSH. 2006 (7): pdb.prot4649. Дои:10.1101 / pdb.prot4649. PMID 22484672.
  17. ^ Чен, Сяоин; Заро, Дженника; Шен, Вэй-Чан (2013-10-15). «Линкеры Fusion Protein: свойства, дизайн и функциональность». Расширенные обзоры доставки лекарств. 65 (10): 1357–1369. Дои:10.1016 / j.addr.2012.09.039. ISSN 0169-409X. ЧВК 3726540. PMID 23026637.
  18. ^ Ханко, Эрик К. Р .; Минтон, Найджел П .; Малыс, Наглис (2019-01-01), Шукла, Арун К. (ред.), «Глава девятая - Дизайн, клонирование и характеристика систем экспрессии индуцируемых генов на основе факторов транскрипции», Методы в энзимологии, Подходы химической и синтетической биологии к пониманию клеточных функций - Часть A, Academic Press, 621: 153–169, Дои:10.1016 / bs.mie.2019.02.018, PMID 31128776, получено 2019-12-16
  19. ^ Каллунки, Туула; Баришич, Марин; Яаттеля, Марья; Лю, Бинь (30.07.2019). "Как выбрать правильную систему экспрессии индуцибельных генов для исследований на млекопитающих?". Клетки. 8 (8): 796. Дои:10.3390 / ячейки8080796. ISSN 2073-4409. ЧВК 6721553. PMID 31366153.
  20. ^ Cheng, K.C .; Инглезе, Дж. (2012). "Система совпадений репортер-ген для высокопроизводительного скрининга". Методы природы. 9 (10): 937. Дои:10.1038 / nmeth.2170. ЧВК 4970863. PMID 23018994.
  21. ^ Hasson, S.A .; Fogel, A.I .; Wang, C .; MacArthur, R .; Guha, R .; Heman-Ackahc, S .; Martin, S .; Youle, R.J .; Инглезе, Дж. (2015). «Хемогеномное профилирование эндогенной экспрессии PARK2 с использованием редактируемого геномом репортера совпадений». ACS Chem. Биол. 10 (5): 1188–1197. Дои:10.1021 / cb5010417. PMID 25689131.
  22. ^ Югдер, Бат-Эрдене; Уэлч, Джеффри; Брейди, Нади; Маркиз, Кристофер П. (26.07.2016). «Создание и использование слияния промотора растворимой гидрогеназы (PSH) aCupriavidus necatorH16 с togfp (зеленый флуоресцентный белок)». PeerJ. 4: e2269. Дои:10.7717 / peerj.2269. ISSN 2167-8359. ЧВК 4974937. PMID 27547572.
  23. ^ Сольберг, Нина; Краусс, Стефан (2013). «Люциферазный анализ для изучения активности клонированного фрагмента промоторной ДНК». Генная регуляция. Методы молекулярной биологии (Клифтон, Нью-Джерси). 977. С. 65–78. Дои:10.1007/978-1-62703-284-1_6. ISBN 978-1-62703-283-4. ISSN 1940-6029. PMID 23436354.
  24. ^ Брюкнер, Анна; Польж, Сесиль; Ленце, Николас; Ауэрбах, Даниэль; Шлаттнер, Уве (18.06.2009). «Двугибридные дрожжи, мощный инструмент для системной биологии». Международный журнал молекулярных наук. 10 (6): 2763–2788. Дои:10.3390 / ijms10062763. ISSN 1422-0067. ЧВК 2705515. PMID 19582228.

внешняя ссылка