WikiDer > БЛАГОСЛОВЕНИЕ

BLESS

БЛАГОСЛОВЕНИЕ, также известен как нарушает маркировку, обогащение стрептавидином и секвенирование следующего поколения, это метод, используемый для обнаружения геном-широкая двунитная Повреждение ДНК.[1] В отличие от иммунопреципитация хроматина (ChIP) методы идентификации Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB), маркируя белки репарации ДНК, BLESS использует биотинилированный Линкеры ДНК для непосредственной маркировки геномной ДНК на месте что позволяет обогащать образцы с высокой специфичностью по стрептавидин бусы и последующие последовательность действийкартирование DSB с разрешением нуклеотидов.

Рабочий процесс

BLESS рабочий процесс. 1) Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) помечены. на месте с проксимальными линкерами шпильки ДНК, содержащими маркер биотина. 2) Клетки фиксируют, лизируют и обрабатывают протеиназами для экстракции и последующего разрезания геномной ДНК (гДНК). 3) Меченые и немеченые фрагменты гДНК пропускаются через гранулы, полученные из стрептавидина, которые захватывают меченые фрагменты с высокой специфичностью из-за сильного сродства маркеров биотина к стрептавидину. 4) После прохождения через гранулы стрептавидина немеченые фрагменты гДНК удаляются, оставляя обогащенные биотином фрагменты гДНК. 5) Дистальный линкер лигируется с мечеными фрагментами гДНК на свободном конце. 6) Эндонуклеаза I-SceI разрезает линкеры на сайте рестрикции для высвобождения фрагментов гДНК из биотина. 7) Праймеры, специфичные для штрих-кода, используются для амплификации обогащенных фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). 8) Секвенирование продуктов ПЦР следующего поколения затем используется для анализа одиночных нуклеотидов DSB в геноме.

Дизайн биотинилированного линкера

Биотинилированный линкер предназначен для образования структура шпильки это специально маркирует DSB, а не разрывы одноцепочечной ДНК. У линкера есть тупик, лигируемый конец с известной последовательностью штрих-кода, который маркирует место лигирования, а также Фермент рестрикции XhoI сайт распознавания рядом со штрих-кодом. Шпилька линкера ковалентно связана с молекулой биотина, что позволяет в дальнейшем обогащать меченую ДНК гранулами стрептавидина.[1]

Использование биотиновых меток позволяет осуществлять специфическое связывание без нарушения ДНК из-за небольшого размера маркера. Поскольку биотин также имеет высокое сродство к стрептавидину, дальнейшая высокоспецифическая очистка может быть проведена на гранулах стрептавидина.[2]

Очистка ядер и на месте маркировка

После индукции DSB клетки фиксируют формальдегидом, лизируют и обрабатывают протеиназы для очистки неповрежденных ядер.[1] Начальный этап фиксации стабилизирует хроматин и предотвращает образование дополнительных DSB во время пробоподготовки.[3] Затем DSB затупляют и инкубируют с биотинилированными линкерами в присутствии ДНК-лигаза Т4. Лигаза Т4 не распознает одноцепочечные разрывы и, как таковая, непосредственно метит сайты DSB посредством ковалентного присоединения биотинилированного линкера.[1]

Извлечение, фрагментация и очистка ДНК

Меченая геномная ДНК извлекается из ядер и фрагментируется Фермент рестрикции HaeIII пищеварение и обработка ультразвуком. Меченые фрагменты ДНК затем очищают с использованием гранул, полученных из стрептавидина, биотин-связывающего белка, обнаруженного в бактериях. Streptomyces avidinii. Поскольку взаимодействие стрептавидина и биотина является сильным и высокоспецифичным, очистка образца на гранулах, покрытых стрептавидином, позволяет надежно обогащать меченые фрагменты ДНК.[1][2]

Мечение и переваривание дистальной линкерной ДНК

Вторая стадия мечения происходит после фрагментации и аффинной очистки биотин-стрептавидин для присоединения сайтов связывания праймера к свободному концу захваченной ДНК. Подобно первому этапу мечения, ДНК-лигаза Т4 используется для присоединения дистального линкера к немеченому концу ДНК. Дистальный линкер также имеет Фермент рестрикции XhoI сайт узнавания, но не связан ковалентно с молекулой биотина. После присоединения дистального линкера захваченные фрагменты ДНК перевариваются с использованием Эндонуклеазы I-SceI которые разрезают как биотинилированные линкеры, так и дистальные линкеры для высвобождения фрагментов ДНК.[1]

ПЦР-амплификация и секвенирование

Расщепленные цепи ДНК амплифицируют с использованием ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям штрих-кода в биотинилированном линкере и дистальном линкере. Амплифицированная ДНК дополнительно обрабатывается путем расщепления рестриктазами XhoI для удаления концов I-SceI и очищается перед секвенированием. Хотя использование секвенирование следующего поколения методы рекомендуется для анализа BLESS, Секвенирование по Сэнгеру также было показано, что он дает успешные, хотя и менее надежные результаты.[1]

Вычислительный анализ

Чтения секвенирования BLESS можно анализировать с помощью программного пакета Instant Sequencing (iSeq).[1] Чтобы обнаружить сайты DSB, чтения выравниваются по эталонный геном с помощью галстук-бабочка для определения положения хромосом. Геном делится на интервалы и гипергеометрические тесты используются для идентификации интервалов, обогащенных отображенными чтениями. DSB идентифицируют путем сравнения обогащения обработанных образцов с контролем. Статистически значимое увеличение в образце, вызванном повреждением ДНК, предполагает, что ДНК в этом интервале является хрупкой и обогащена DSB.[4]

Преимущества

  1. Использование линкеров биотинилированной ДНК, предназначенных для специфического распознавания разрывов двухцепочечной ДНК, позволяет проводить менее предвзятый, более прямой обзор батома без необходимости полагаться на нативные и / или DSB-прокси-белки, такие как фосфорилированный вариант гистона H2A.X (γH2A.X) в ячейке.[5] Из-за этого БЛЕСС можно использовать в различных клетках разных организмов.
  2. По той же причине BLESS также чувствителен к множественным источникам двухцепочечных разрывов, таким как химическое и физическое разрушение ДНК, остановка репликационной вилки, а также наличие теломер заканчивается.[1] Это делает BLESS подходящим для анализа клеток в различных условиях.
  3. Маркировка DSB происходит на месте, снижая риск ложных срабатываний при обнаружении разрывов ДНК из-за механического сдвига и химической обработки образцов.

Ограничения

  1. Из-за специфичности конструкции линкера биотинилированные маркеры могут метить только двухцепочечные разрывы ДНК на тупойне сплоченный заканчивается, что приводит к менее эффективной перевязке.
  2. По сравнению с более новым ломаться Методы исследования, такие как BLISS, BLESS, требуют большого количества клеточного исходного материала для успешного анализа, что приводит к утомительной и трудоемкой подготовке и обработке образцов. Для обработки 24 образцов протокол BLESS требует 60 рабочих часов в течение 15 дней, тогда как BLISS требует 12 рабочих часов в течение 5 дней.[6]
  3. Поскольку клетки требуют химической фиксации перед экстракцией ДНК, BLESS подвержен высокому фоновому шуму от артефактов фиксации. Однако было показано, что строгая индивидуальная оптимизация уменьшает эту проблему.[7]
  4. Из-за отсутствия контролей ПЦР BLESS не является полностью количественным методом и склонен к смещению амплификации, что приводит к плохой масштабируемости.
  5. BLESS подходит только для обнаружения двухцепочечных разрывов в определенное время в геноме по сравнению с непрерывным анализом.

Альтернативные методы

Нарушает маркировку in situ и секвенирование (BLISS)
В BLISS клетки или срезы тканей прикрепляются к покровное стекло сначала перед маркировкой DSB. Это позволяет некоторым центрифугирование шаги, которые следует опустить, тем самым уменьшая количество искусственных DSB, вводимых при пробоподготовке, и уменьшая потери пробы. Важно отметить, что он позволяет использовать гораздо меньшее количество исходного материала по сравнению с BLESS. Еще одно улучшение - использование in vitro транскрипция генерировать и усиливать РНК последовательности для подготовка библиотеки. BLISS использует Бактериофаг Т7-опосредованная транскрипция, а не ПЦР, что снижает количество ошибок, вызванных смещением амплификации ПЦР, которые возникают при BLESS.[6]
Иммобилизованный-БЛЕСС (i-BLESS)
Ограничением оригинального метода BLESS является то, что он проблематичен в применении к меньшим ячейкам, таким как дрожжевые клетки. Хотя низкие скорости центрифугирования, используемые во время выделения ядер, недостаточно эффективны для малых клеток, увеличение скорости центрифугирования может привести к сдвигу геномной ДНК. Однако в i-BLESS клетки иммобилизованы в бусины агарозы до маркировки DSB.[8] Это позволяет использовать более высокие скорости центрифугирования без искусственного разрезания ДНК. Остальная часть процедуры маркировки DSB соответствует методу BLESS, и меченые фрагменты ДНК извлекаются из гранул агарозы до стадии захвата стрептавидина. Метод i-BLESS не ограничивается дрожжами и теоретически может применяться ко всем клеткам.
DSBCapture
Подобно BLESS, DSBCapture использует биотинилированные адаптеры для маркировки DSB. на месте и гранулы стрептавидина для выделения меченых фрагментов ДНК для амплификации и секвенирования.[9] В то время как маркировка в BLESS опирается на лигирование тупых концов, DSBCapture использует более эффективные лигирование когезионных концов прикрепить биотинилированный модифицированный Адаптеры Illumina. Кроме того, DSBCapture использует меньшее количество этапов ПЦР по сравнению с BLESS, что снижает смещение амплификации.[10] Этот метод также генерирует библиотеки с более высоким разнообразием последовательностей, чем BLESS, устраняя необходимость добавления в другие библиотеки для улучшения разнообразия перед секвенированием. Кроме того, DSBCapture использует одностороннее секвенирование, в отличие от BLESS, где секвенирование может начинаться с обоих концов. Результаты одностороннего секвенирования отражают только последовательности сайтов DSB, улучшая выход данных.[11]
GUIDE-Seq
GUIDE-Seq, также известный как беспристрастная идентификация DSB с помощью секвенирования на уровне генома, использует включение двухцепочечный олигодезоксинуклеотид (dsODN) последовательности для мечения сайтов DSB в живых клетках.[12] Это позволяет маркировать DSB в течение длительного периода времени, а участки повреждения ДНК, идентифицированные с помощью GUIDE-Seq, отражают накопленные DSB. Напротив, BLESS только маркирует и обнаруживает временные DSB, которые существуют, когда ячейки были зафиксированы.

Приложения

Хотя двухцепочечные разрывы в ДНК могут быть вызваны различными источниками разрушения, они часто наблюдаются с высокой частотой во время апоптоз и может способствовать нестабильности генома, что приводит к онкогенным мутациям.[1][13] По этой причине специальные методы DSB-картирования с высоким разрешением, такие как BLESS, полезны для исследований с разбивкой.

DSB могут быть искусственно вызваны с помощью редактирование генома такие технологии как CRISPR-Cas9 или ТАЛЕН. Эти технологии могут привести к непреднамеренным модификациям ДНК в нецелевых участках генома.[14] Поскольку BLESS может идентифицировать нуклеотидное положение DSB, его можно использовать для определения того, нецелевое редактирование генома произошло и обнаружение DSB, непреднамеренно введенных этими нуклеазными системами.[7]

использованная литература

  1. ^ а б c d е ж г час я j Крозетто Н., Митра А., Сильва М.Дж., Биенко М., Дойер Н., Ван К., Карака Е., Кьярле Р., Скшипчак М., Гинальски К., Пасеро П., Ровицка М., Дикич I. (апрель 2013 г.). «Картирование двухцепочечных разрывов ДНК с разрешением нуклеотидов с помощью секвенирования следующего поколения». Методы природы. 10 (4): 361–5. Дои:10.1038 / nmeth.2408. ЧВК 3651036. PMID 23503052.
  2. ^ а б «Взаимодействие авидин-биотин - CA». www.thermofisher.com. Получено 2019-03-01.
  3. ^ Козубек С., Лукасова Е., Амрихова Дж., Козубек М., Лискова А., Слотова Дж. (Июнь 2000 г.). «Влияние клеточной фиксации на топографию хроматина». Аналитическая биохимия. 282 (1): 29–38. Дои:10.1006 / abio.2000.4538. PMID 10860496.
  4. ^ «БЛАГОСЛОВЕНИЕ: нанесите на карту двухцепочечные разрывы ДНК по всему геному с помощью секвенирования следующего поколения». breakome.utmb.edu. Получено 2019-03-01.
  5. ^ Шарма А., Сингх К., Алмасан А. (2012). Фосфорилирование гистона H2AX: маркер повреждения ДНК. Методы молекулярной биологии. 920. С. 613–26. Дои:10.1007/978-1-61779-998-3_40. ISBN 978-1-61779-997-6. PMID 22941631.
  6. ^ а б Ян В.X., Мирзазаде Р., Гарнероне С., Скотт Д., Шнайдер М. В., Каллас Т., Кустодио Дж., Вернерссон Э., Ли Ю., Гао Л., Федерова Ю., Цетше Б., Чжан Ф., Биенко М., Крозетто Н. (май 2017 г.). «BLISS - это универсальный и количественный метод для полногеномного профилирования двухцепочечных разрывов ДНК». Nature Communications. 8: 15058. Дои:10.1038 / ncomms15058. ЧВК 5437291. PMID 28497783.
  7. ^ а б Бауман Б.А., Крозетто Н. (декабрь 2018 г.). «Двухцепочечные разрывы эндогенной ДНК во время транзакций ДНК: новые идеи и методы профилирования на уровне всего генома». Гены. 9 (12): 632. Дои:10.3390 / гены9120632. ЧВК 6316733. PMID 30558210.
  8. ^ Biernacka A, Zhu Y, Skrzypczak M, Forey R, Pardo B, Grzelak M, Nde J, Mitra A, Kudlicki A, Crosetto N, Pasero P, Rowicka M, Ginalski K (2018). «i-BLESS - сверхчувствительный метод обнаружения двухцепочечных разрывов ДНК». Биология коммуникации. 1 (1): 181. Дои:10.1038 / с42003-018-0165-9. ЧВК 6208412. PMID 30393778.
  9. ^ Lensing SV, Marsico G, Hänsel-Hertsch R, Lam EY, Tannahill D, Balasubramanian S (октябрь 2016 г.). «DSBCapture: захват in situ и секвенирование разрывов ДНК». Методы природы. 13 (10): 855–7. Дои:10.1038 / nmeth.3960. ЧВК 5045719. PMID 27525976.
  10. ^ Эйрд Д., Росс М.Г., Чен В.С., Даниэльссон М., Феннелл Т., Расс С., Джаффе Д. Б., Нусбаум С., Гнирке А. (2011). «Анализ и минимизация систематической ошибки амплификации ПЦР в библиотеках секвенирования Illumina». Геномная биология. 12 (2): R18. Дои:10.1186 / gb-2011-12-2-r18. ЧВК 3188800. PMID 21338519.
  11. ^ Митра А, Скшипчак М, Гинальски К., Ровицка М (2015). «Стратегии достижения высокой точности секвенирования для образцов с низким разнообразием и предотвращения утечки образцов с использованием платформы illumina». PLOS One. 10 (4): e0120520. Дои:10.1371 / journal.pone.0120520. ЧВК 4393298. PMID 25860802.
  12. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (февраль 2015 г.). «GUIDE-seq позволяет профилировать геномное расщепление с помощью нуклеаз CRISPR-Cas». Природа Биотехнологии. 33 (2): 187–197. Дои:10.1038 / nbt.3117. ЧВК 4320685. PMID 25513782.
  13. ^ Апарисио Т., Бэр Р., Готье Дж. (Июль 2014 г.). «Выбор пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК и рак». Ремонт ДНК. 19: 169–75. Дои:10.1016 / j.dnarep.2014.03.014. ЧВК 4051845. PMID 24746645.
  14. ^ Фу Й, Фоден Дж. А., Хайтер С., Мэдер М. Л., Рейон Д., Джунг Дж. К., Сандер Дж. Д. (сентябрь 2013 г.). «Высокочастотный мутагенез вне мишени, индуцированный нуклеазами CRISPR-Cas в клетках человека». Природа Биотехнологии. 31 (9): 822–6. Дои:10.1038 / nbt.2623. ЧВК 3773023. PMID 23792628.

внешние ссылки