WikiDer > DRIP-seq

DRIP-seq

DRIP-seq (DRIP-секвенирование) представляет собой технологию полногеномного профилирования типа гибрида ДНК-РНК, называемого "R-петля".[1] DRIP-seq использует независимую от последовательности, но зависящую от структуры антитело для ДНК-РНК иммунопреципитация (DRIP) для захвата R-петель для массового параллелизма Секвенирование ДНК.[1]

Вступление

R-петля и моноклональное антитело S9.6

R-петля - это трехцепочечная нуклеиновая кислота структура, которая состоит из гибридного дуплекса ДНК-РНК и смещенной одноцепочечной ДНК (оцДНК).[2] R-петли образуются преимущественно в цитозин-богатые области генома во время транскрипция[2] и известно, что они связаны с экспрессия гена и переключение класса иммуноглобулинов.[1][3][4] Они были обнаружены у самых разных видов, от бактерий до млекопитающих.[2] Они преимущественно локализуются на Остров CpG промоутеры в клетках человека и в высокотранскрибируемых областях дрожжей.[1][3]

В ненормальных условиях, а именно повышенном производстве гибридов ДНК-РНК, R-петли могут вызывать нестабильность генома подвергая одноцепочечную ДНК эндогенным повреждениям, вызываемым действием ферментов, таких как ПОМОГАТЬ и АПОБЕК, или чрезмерное воздействие химически активных веществ.[4] Следовательно, понимание того, где и при каких обстоятельствах образуются R-петли в геноме, имеет решающее значение для лучшего понимания нестабильности генома. Первоначально характеристика R-петли ограничивалась подходами, специфичными для локусов.[5] Однако по прибытии массивное параллельное секвенирование технологий, а затем их производных, таких как DRIP-seq, открылась возможность исследовать целые геномы на предмет R-петель.

DRIP-seq основан на высокой специфичности и аффинности S9.6. моноклональное антитело (mAb) по отношению к гибридам ДНК-РНК различной длины. S9.6 mAb были впервые созданы и охарактеризованы в 1986 году и в настоящее время используются для селективной иммунопреципитации R-петель.[6] С тех пор он использовался в различных методах иммунопреципитации для характеристики R-петли.[1][3][7][8] Концепция DRIP-seq похожа на ChIP-секвенирование; Фрагменты R-петли являются основным иммунопреципитированным материалом в DRIP-seq.

Использование и текущие исследования

DRIP-seq в основном используется для картирования R-петель по всему геному. Идентификация сайтов образования R-петли позволяет изучать различные клеточные события, такие как функция образования R-петли в определенных областях, характеристика этих областей и влияние на экспрессию генов. Его также можно использовать для изучения влияния R-петель на другие процессы, такие как репликация и синтез ДНК. Косвенно DRIP-seq может выполняться на мутантных клеточных линиях, дефицитных по генам, участвующим в разрешении R-петли.[3] Эти типы исследований предоставляют информацию о роли мутировавшего гена в подавлении образования ДНК-РНК и, возможно, о значении R-петель в нестабильности генома.

DRIP-seq был впервые использован для полногеномного профилирования R-петель у человека, что показало широко распространенное образование R-петли на промоторах CpG-островков.[1] В частности, исследователи обнаружили, что образование R-петли связано с неметилированным состоянием CpG-островков.

DRIP-seq позже был использован для профилирования образования R-петли в сайтах начала и терминации транскрипции в плюрипотенте человека. Клетки Ntera2.[7] В этом исследовании ученые обнаружили, что R-петли на 3'-концах генов могут коррелировать с терминацией транскрипции.

Рабочий процесс DRIP-seq

Рабочий процесс DRIP-seq

Извлечение геномной ДНК

Первый, геномная ДНК (гДНК) экстрагируют из представляющих интерес клеток обработкой протеиназой К с последующим фенол-хлороформная экстракция и осаждение этанолом. Для дрожжевых клеток необходимо дополнительное переваривание зимолиазой для удаления клеточной стенки до протеиназа К лечение. гДНК также может быть извлечена множеством других методов, таких как методы на основе столбцов.

Фрагментация геномной ДНК

гДНК обрабатывается Нуклеаза S1 удалить нежелательную оцДНК и РНКс последующим осаждением этанолом для удаления нуклеазы S1. Затем гДНК фрагментируется эндонуклеаза рестрикции, давая фрагменты двухцепочечной ДНК (дцДНК) разного размера. Альтернативно, фрагменты гДНК могут быть получены с помощью обработка ультразвуком.

Иммунопреципитация

Фрагментированную гДНК инкубируют с mAb S9.6, специфичной к структуре ДНК-РНК. Этот шаг является уникальным для протокола DRIP-seq, поскольку он полностью основан на высокой специфичности и сродстве mAb S9.6 к гибридам ДНК-РНК. Антитело распознает и связывает эти области, распределенные по геном и будет использоваться для иммунопреципитации. Антитела S9.6 связываются с магнитными шариками путем взаимодействия со специфическими лигандами (т.е. белок А или же белок G) на поверхности бусинок. Таким образом, фрагменты, содержащие ДНК-РНК, будут связываться с гранулами посредством антитела.

Элюция

Магнитные шарики промывают для удаления любой гДНК, не связанной с шариками, серией промывок, и гибриды ДНК-РНК выделяют элюированием. Для удаления антитела, связанного с гибридами нуклеиновых кислот, проводят обработку протеиназой К с последующей экстракцией фенол-хлороформ и осаждением этанолом. Это приводит к выделению очищенных гибридов ДНК-РНК различного размера.

Последовательность действий

Для массивного параллельного секвенирования этих фрагментов иммунопреципитированный материал обрабатывается ультразвуком, выбирается размер и лигируется со штрих-кодом. олигонуклеотид адаптеры для обогащения и секвенирования кластеров.

Вычислительный анализ

Чтобы обнаружить сайты образования R-петли, сотни миллионов считываний секвенирования из DRIP-seq сначала выравниваются по эталонный геном с выравниватель последовательности короткого чтения, тогда пик вызова методы, разработанные для ChIP-seq, могут использоваться для оценки сигналов DRIP.[1] Если для разных экспериментов DRIP-seq с одним и тем же образцом использовались разные коктейли рестрикционных ферментов, вызываются консенсусные пики DRIP-seq.[7] Обычно пики сравнивают с пиками соответствующего РНКаза H1-обработанный образец, служащий входным контролем.[1][7]

Ограничения

Из-за отсутствия другого основанного на антителах метода иммунопреципитации R-петли проверка результатов DRIP-seq затруднена. Однако результаты других методов профилирования R-цикла, таких как DRIVE-seq, могут использоваться для измерения консенсуса.

С другой стороны, DRIP-seq полагается на существующие платформы короткого чтения для секвенирования R-петель. Другими словами, все ограничения, присущие этой платформе, также применимы к DRIP-seq. В частности, типичные платформы секвенирования с коротким чтением будут давать неравномерное покрытие для чтения в областях, богатых GC. Секвенирование длинных R-петель может представлять проблему, потому что R-петли преимущественно образуются в богатых цитозином участках ДНК. Более того, GC-богатые регионы, как правило, имеют низкую сложность по своей природе, что затрудняет выравниванию для короткого считывания для получения уникальных выравниваний.

Другие методы профилирования R-петли

Хотя существует несколько других методов анализа и профилирования образования R-петли,[5][9][10][11][12][13][14][15][16] лишь немногие из них обеспечивают охват и надежность в масштабе всего генома.[1][3]

  • Неденатурирующая модификация бисульфита и секвенирование: Этот метод состоит из обработка бисульфитом с последующим секвенированием и основан на мутагенном действии бисульфита натрия на оцДНК. Хотя этот метод в основном используется для локализации определенных промоторов CpG-островков,[1] он использовался для обнаружения R-петель в меньшем масштабе[5] и другие хрупкие сайты оцДНК.[17]
  • ДНК: обогащение РНК in vitro (DRIVE-seq):[1] Этот метод имеет очень похожие принципы DRIP-seq, за исключением использования эндонуклеазы MBP-RNASEH1 вместо mAb S9.6 для восстановления R-петель. MBP-RNASEH1 представляет собой альтернативу мАт S9.6, когда требуется дополнительный анализ захвата, однако чрезмерная экспрессия этой эндонуклеазы может привести к цитотоксическим рискам. in vivo.
  • ДНК: иммнунопреципитация РНК с последующей гибридизацией на мозаичном микрочипе (DRIP-чип):[3] Этот метод также основан на использовании mAb S9.6. Однако вместо того, чтобы попасть в конвейер секвенирования, иммунопреципитированный материал в DRIP-чипе гибридизируется с микрочип. Преимущество DRIP-чипа перед DRIP-seq - быстрое получение данных. Ограничивающими факторами этого метода являются количество зондов на микрочипах и отсутствие информации о последовательности ДНК.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k Джинно, Пенсильвания; Лотт, Польша; Christensen, HC; Корф, I; Chédin, F (30 марта 2012 г.). «Образование R-петли является отличительной особенностью неметилированных промоторов CpG-островков человека». Молекулярная клетка. 45 (6): 814–25. Дои:10.1016 / j.molcel.2012.01.017. ЧВК 3319272. PMID 22387027.
  2. ^ а б c Агилера, А; Гарсия-Муза, Т. (27 апреля 2012 г.). «R-петли: от побочных продуктов транскрипции до угроз стабильности генома». Молекулярная клетка. 46 (2): 115–24. Дои:10.1016 / j.molcel.2012.04.009. PMID 22541554.
  3. ^ а б c d е ж Чан, Ю.А.; Аристизабал, MJ; Лу, ПЯ; Луо, Z; Хамза, А; Кобор, М.С.; Стирлинг, ПК; Хитер, П. (апрель 2014 г.). «Полногеномное профилирование дрожжевой ДНК: сайты гибридов РНК с DRIP-чипом». PLOS Genetics. 10 (4): e1004288. Дои:10.1371 / journal.pgen.1004288. ЧВК 3990523. PMID 24743342.
  4. ^ а б Чаудхури, Дж; Тиан, М; Кхыонг, К; Chua, K; Pinaud, E; Альт, FW (17 апреля 2003 г.). «Нацеленное на транскрипцию дезаминирование ДНК ферментом диверсификации антител AID». Природа. 422 (6933): 726–30. Дои:10.1038 / природа01574. PMID 12692563.
  5. ^ а б c Ю, К; Chedin, F; Hsieh, CL; Wilson, TE; Либер, М.Р. (май 2003 г.). «R-петли в областях переключения класса иммуноглобулинов в хромосомах стимулированных В-клеток». Иммунология природы. 4 (5): 442–51. Дои:10.1038 / ni919. PMID 12679812.
  6. ^ Богуславски, SJ; Smith, DE; Михалак, Массачусетс; Mickelson, KE; Йехле, Колорадо; Паттерсон, WL; Каррико, Р.Дж. (1 мая 1986 г.). «Характеристика моноклональных антител к ДНК-РНК и ее применение для иммунодетекции гибридов». Журнал иммунологических методов. 89 (1): 123–30. Дои:10.1016/0022-1759(86)90040-2. PMID 2422282.
  7. ^ а б c d Джинно, Пенсильвания; Лим, YW; Лотт, Польша; Корф, I; Chédin, F (октябрь 2013 г.). «Смещение GC на 5'- и 3'-концах генов человека связывает образование R-петли с эпигенетической регуляцией и прекращением транскрипции». Геномные исследования. 23 (10): 1590–600. Дои:10.1101 / гр.158436.113. ЧВК 3787257. PMID 23868195.
  8. ^ Скурти-Статхаки, К; Праудфут, штат Нью-Джерси; Громак, Н (24 июня 2011 г.). «Сенатаксин человека разрешает гибриды РНК / ДНК, образованные в сайтах транскрипционной паузы, чтобы способствовать Xrn2-зависимой терминации». Молекулярная клетка. 42 (6): 794–805. Дои:10.1016 / j.molcel.2011.04.026. ЧВК 3145960. PMID 21700224.
  9. ^ Эль-Хаге, А; Французский, SL; Бейер, AL; Толлервей, Д. (15 июля 2010 г.). «Потеря топоизомеразы I приводит к опосредованным R-петлей блокам транскрипции во время синтеза рибосомной РНК». Гены и развитие. 24 (14): 1546–58. Дои:10.1101 / gad.573310. ЧВК 2904944. PMID 20634320.
  10. ^ Duquette, ML; Huber, MD; Майзельс, N (15 марта 2007 г.). «Богатые G протоонкогены нацелены на геномную нестабильность в B-клеточных лимфомах». Исследования рака. 67 (6): 2586–94. Дои:10.1158 / 0008-5472.can-06-2419. PMID 17363577.
  11. ^ Huertas, P; Агилера, А (сентябрь 2003 г.). «Котранскрипционно сформированная ДНК: гибриды РНК опосредуют нарушение элонгации транскрипции и рекомбинацию, связанную с транскрипцией». Молекулярная клетка. 12 (3): 711–21. Дои:10.1016 / j.molcel.2003.08.010. PMID 14527416.
  12. ^ Дролет, М; Bi, X; Лю, Л.Ф. (21 января 1994 г.). «Гиперотрицательная суперспирализация матрицы ДНК во время удлинения транскрипции in vitro». Журнал биологической химии. 269 (3): 2068–74. PMID 8294458.
  13. ^ Гомес-Гонсалес, B; Агилера, А (15 мая 2007 г.). «Вызванное активацией действие цитидиндезаминазы сильно стимулируется мутациями комплекса THO». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 104 (20): 8409–14. Дои:10.1073 / pnas.0702836104. ЧВК 1895963. PMID 17488823.
  14. ^ Pohjoismäki, JL; Холмс, JB; Дерево, SR; Ян, МЫ; Ясукава, Т; Рейес, А; Бейли, ЖЖ; Cluett, TJ; Goffart, S; Willcox, S; Ригби, RE; Джексон, AP; Spelbrink, JN; Гриффит, Дж. Д.; Крауч, RJ; Джейкобс, HT; Холт, Эй Джей (16 апреля 2010 г.). «Промежуточные продукты репликации митохондриальной ДНК млекопитающих по существу являются дуплексными, но содержат обширные участки гибрида РНК / ДНК». Журнал молекулярной биологии. 397 (5): 1144–55. Дои:10.1016 / j.jmb.2010.02.029. ЧВК 2857715. PMID 20184890.
  15. ^ Мишо, ОН; Гомес-Гонсалес, B; Гжечник, П; Rondón, AG; Вэй, Вт; Steinmetz, L; Агилера, А; Праудфут, Нью-Джерси (7 января 2011 г.). «Дрожжевая геликаза Sen1 защищает геном от нестабильности, связанной с транскрипцией». Молекулярная клетка. 41 (1): 21–32. Дои:10.1016 / j.molcel.2010.12.007. ЧВК 3314950. PMID 21211720.
  16. ^ Вахба, L; Amon, JD; Кошланд, Д; Вуйка-Росс, М. (23 декабря 2011 г.). «РНКаза Н и множество факторов биогенеза РНК взаимодействуют, чтобы предотвратить гибриды РНК: ДНК от создания нестабильности генома». Молекулярная клетка. 44 (6): 978–88. Дои:10.1016 / j.molcel.2011.10.017. ЧВК 3271842. PMID 22195970.
  17. ^ Чан, К; Стерлинг, JF; Робертс, SA; Bhagwat, AS; Резник, Массачусетс; Горденин, Д.А. (2012). «Повреждение оснований в одноцепочечной ДНК лежит в основе гипермутабильности in vivo, вызванной повсеместным агентом окружающей среды». PLOS Genetics. 8 (12): e1003149. Дои:10.1371 / journal.pgen.1003149. ЧВК 3521656. PMID 23271983.