WikiDer > Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Electrophoretic mobility shift assay
Дорожка 1 является отрицательным контролем и содержит только генетический материал. Дорожка 2 содержит белок, а также фрагмент ДНК, который, исходя из своей последовательности, не взаимодействует. Дорожка 3 содержит белок и фрагмент ДНК, который действительно реагирует; Полученный комплекс больше, тяжелее и медленнее. Образец, показанный на дорожке 3, является тем, который был бы результатом, если бы вся ДНК была связана и не происходило диссоциации комплекса во время электрофореза. Когда эти условия не соблюдаются, на дорожке 3 можно увидеть вторую полосу, отражающую присутствие свободной ДНК или диссоциацию комплекса ДНК-белок.

An анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) или электрофорез сдвига подвижности, также называемый анализ сдвига геля, анализ сдвига подвижности геля, анализ сдвига полосы, или же анализ задержки геля, является обычным аффинный электрофорез техника, используемая для изучения белок – ДНК или же белок–РНК взаимодействия. Эта процедура может определить, способен ли белок или смесь белков связываться с данной последовательностью ДНК или РНК, а иногда может указывать на то, участвует ли более одной белковой молекулы в связывающем комплексе. Часто проводятся анализы сдвига геля in vitro одновременно с Отслеживание ДНКазы, удлинение праймера, и промоторно-зондовые эксперименты при изучении транскрипция инициация, репликация ДНК, репарация ДНК или обработка и созревание РНК, а также сплайсинг пре-мРНК.[1] Хотя прекурсоры можно найти в более ранней литературе, большинство современных анализов основаны на методах, описанных Гарнером и Ревзином. [2] и жареный и Crothers.[3]

Принцип

Анализ сдвига подвижности электрофоретическое разделение смеси белок-ДНК или белок-РНК на полиакриламид или же агарозный гель на короткий период (около 1,5-2 часов для геля размером 15-20 см).[4] Скорость, с которой различные молекулы (и их комбинации) перемещаются через гель, определяется их размером и зарядом и, в меньшей степени, их формой (см. гель-электрофорез). Контрольная дорожка (ДНК-зонд без белка) будет содержать единственную полосу, соответствующую несвязанному фрагменту ДНК или РНК. Однако, если предположить, что белок способен связываться с фрагментом, дорожка с белком, который связывается, будет содержать другую полосу, которая представляет более крупный, менее мобильный комплекс зонда нуклеиновой кислоты, связанный с белком, который «сдвинут» вверх на геле. (поскольку он двигался медленнее).

В правильных экспериментальных условиях взаимодействие между ДНК (или РНК) и белком стабилизируется, а соотношение связанных и несвязанных нуклеиновых кислот на геле отражает долю свободных и связанных молекул зонда, когда реакция связывания входит в гель. Эта стабильность частично обусловлена ​​«эффектом клетки», когда белок, окруженный гелевой матрицей, не может диффундировать от зонда до того, как они рекомбинируют.[5] Если исходные концентрации белка и зонда известны, и если известна стехиометрия комплекса, можно определить кажущееся сродство белка к последовательности нуклеиновой кислоты.[6] Если комплекс не является очень долгоживущим в условиях геля или не учитывается диссоциация во время электрофореза, полученное число является кажущимся Kd. Если концентрация белка неизвестна, но известна сложная стехиометрия, концентрацию белка можно определить, увеличивая концентрацию ДНК-зонда до тех пор, пока дальнейшие приращения не увеличат долю связанного белка. Путем сравнения с набором стандартных разведений свободного зонда, запускаемого на том же геле, можно рассчитать количество молей белка.[4]

Варианты и дополнения

К этой смеси можно добавить антитело, распознающее белок, для создания еще более крупного комплекса с большим сдвигом. Этот метод называется сверхсдвиг, и используется для однозначной идентификации белка, присутствующего в комплексе белок-нуклеиновая кислота.

Часто дополнительная полоса проходит вместе с участником. олигонуклеотид для определения наиболее подходящей связывающей последовательности для связывающего белка. Использование различных олигонуклеотидов с определенной последовательностью позволяет идентифицировать точный сайт связывания по конкуренции (не показано на диаграмме). Варианты конкурентного анализа полезны для измерения специфичности связывания и для измерения кинетики ассоциации и диссоциации. Таким образом, EMSA можно также использовать как часть эксперимента SELEX для отбора олигонуклеотидов, которые действительно связывают данный белок.[нужна цитата]

После определения связывания ДНК с белком in vitro, ряд алгоритмов может сузить поиск по идентификации фактора транскрипции. Олигонуклеотиды консенсусной последовательности для интересующего фактора транскрипции будут способны конкурировать за связывание, устраняя сдвинутую полосу, и должны быть подтверждены суперсдвигом. Если предсказанная консенсусная последовательность не может конкурировать за связывание, идентификации фактора транскрипции может помочь Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), посредством чего большие наборы консенсусных последовательностей мультиплексируются в каждой реакции, и когда один набор конкурирует за связывание, отдельные консенсусные последовательности из этого набора запускают в дальнейшей реакции.[7]

Для визуализации фрагмент нуклеиновой кислоты обычно помечен символом радиоактивный, флуоресцентный или же биотин метка. Стандарт этидиум бромид окрашивание менее чувствительно, чем эти методы, и может не обладать чувствительностью для обнаружения нуклеиновой кислоты, если в этих экспериментах используются небольшие количества нуклеиновой кислоты или одноцепочечной нуклеиновой кислоты (кислот). При использовании метки с биотином стрептавидин конъюгированный с ферментом, таким как пероксидаза хрена, используется для обнаружения фрагмента ДНК.[8][9] Хотя изотопное мечение ДНК оказывает незначительное влияние или не влияет на аффинность связывания с белком, использование неизотопных меток, включая флурофоры или биотин, может изменять сродство и / или стехиометрию интересующего взаимодействия белков. Конкуренция между зондом, меченным флуорофором или биотином, и немеченой ДНК той же последовательности может использоваться для определения того, изменяет ли метка аффинность связывания или стехиометрию.

Рекомендации

  1. ^ Гранадино Б., Пеналва Л.О., Грин М.Р., Валкарсель Дж., Санчес Л. 1997. Proc NatlAcad Sci U S A 94: 7343-8.
  2. ^ Гарнер М.М., Ревзин А. (июль 1981 г.). «Метод гель-электрофореза для количественной оценки связывания белков с конкретными участками ДНК: применение к компонентам системы регуляции оперона лактозы Escherichia coli». Нуклеиновые кислоты Res. 9 (13): 3047–60. Дои:10.1093 / nar / 9.13.3047. ЧВК 327330. PMID 6269071.
  3. ^ Фрид М., Кротерс Д.М. (декабрь 1981 г.). «Равновесия и кинетика взаимодействий lac-репрессор-оператор при электрофорезе в полиакриламидном геле». Нуклеиновые кислоты Res. 9 (23): 6505–25. Дои:10.1093 / nar / 9.23.6505. ЧВК 327619. PMID 6275366.
  4. ^ а б Осубель, Фредерик М. (1994). Текущие протоколы в молекулярной биологии. Чичестер: Джон Уайли и сыновья. С. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1.
  5. ^ Жареный MG, Лю G (1994). «Молекулярная секвестрация стабилизирует комплексы CAP-ДНК во время электрофореза в полиакриламидном геле». Исследования нуклеиновых кислот. 22 (23): 5054–5059. Дои:10.1093 / nar / 22.23.5054. ЧВК 523777. PMID 7800499.
  6. ^ Жареный MG (1989). «Измерение параметров взаимодействия белок-ДНК с помощью анализа сдвига подвижности электрофореза». Электрофорез. 10 (5–6): 366–376. Дои:10.1002 / elps.1150100515. PMID 2670548. S2CID 19372331.
  7. ^ Смит А.Дж., Хамфрис С.Е. (январь 2009 г.). «Характеристика ДНК-связывающих белков с использованием мультиплексированного конкурента EMSA». J. Mol. Биол. 385 (3): 714–7. Дои:10.1016 / j.jmb.2008.11.035. PMID 19059416.
  8. ^ Хеллман, Лэнс М; Фрид, Майкл G (2007). «Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота». Протоколы природы. 2 (8): 1849–1861. Дои:10.1038 / nprot.2007.249. ISSN 1754-2189. ЧВК 2757439. PMID 17703195.
  9. ^ Осмосенсинг и осмосигнализация. Академическая пресса. 1 октября 2007 г. С. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.

внешняя ссылка