WikiDer > Северо-западное пятно

Northwestern blot

В северо-западное пятно, также известный как северо-западный пробирный, представляет собой гибридный аналитический метод вестерн-блот и северное пятно, и используется в молекулярная биология для обнаружения взаимодействий между РНК и белки. Родственный метод, вестерн-блоттинг, используется для обнаружения интересующего белка, который включает перенос белков, разделенных гель-электрофорез на нитроцеллюлозную мембрану. Цветной осадок группируется вдоль полосы на мембране, содержащей определенный целевой белок. Нозерн-блоттинг - это аналогичный аналитический метод, который вместо обнаружения интересующего белка используется для изучения экспрессии генов путем обнаружения РНК (или выделенной мРНК) на аналогичной мембране. Северо-западный блот сочетает в себе эти два метода и, в частности, включает идентификацию меченой РНК, которая взаимодействует с белками, иммобилизованными на аналогичной нитроцеллюлозной мембране.

История

Эдвин Южный впервые создал Саузерн-блот,[1] аналитический метод, используемый для обнаружения ДНК. Техника предполагает использование гель-электрофорез, важный аналитический метод, который включает использование электрического поля и последующую миграцию заряженных ДНК, РНК или белков через это электрическое поле в зависимости от размера и заряда.[2] Затем с помощью саузерн-блоттинга разделенные фрагменты ДНК переносятся на фильтрующую мембрану для обнаружения.[1] Обнаружение происходит, когда полосы становятся видимыми на мембране и соотносятся с конкретной интересующей молекулой.[2] Впоследствии были созданы другие подобные методы блоттинга с аналогичной номенклатурой для обнаружения различных молекул или взаимодействий между молекулами. Эти методы включают вестерн-блот (обнаружение белка), северное пятно (Обнаружение РНК), юго-западное пятно (Обнаружение взаимодействия ДНК с белками), восточная клякса (обнаружение посттрансляционной модификации) и северо-западный блот (обнаружение взаимодействия РНК-белок).[3][4][5][6]

Специфика техники

Выполнение северо-западного блоттинга включает разделение РНК связывание белков гель-электрофорез, который будет разделять белки, связывающие РНК, в зависимости от их размера и заряда. Отдельные образцы могут быть загружены в агароза или полиакриламид гель (обычно SDS-PAGE) для одновременного анализа нескольких образцов.[5] После завершения гель-электрофореза гель и связанные с ним связывающие РНК белки переносятся на нитроцеллюлозную бумагу для переноса.[7]

Затем вновь перенесенные блоты замачивают в блокирующем растворе; обезжиренное молоко и бычий сывороточный альбумин являются обычными блокирующими буферами.[8] Этот блокирующий раствор помогает предотвратить неспецифическое связывание первичных и / или вторичных антител с нитроцеллюлозной мембраной. Как только блокирующий раствор имеет достаточное время контакта с блотом, наносится конкретная конкурирующая РНК и дается время для инкубации при комнатной температуре. В течение этого времени конкурирующая РНК связывается с РНК-связывающими белками в образцах, находящихся на блоте. Время инкубации во время этого процесса может варьироваться в зависимости от концентрации применяемой конкурирующей РНК; хотя время инкубации обычно составляет один час.[9] После завершения инкубации блот обычно промывают не менее 3 раз по 5 минут при каждой промывке, чтобы разбавить РНК в растворе. Общие промывочные буферы включают Физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) или 10% Подросток 20 решение.[10] Неправильная или неадекватная промывка повлияет на четкость проявления пятна. После завершения промывки блот обычно проявляется Рентгеновский или похожие авторадиография методы.[11]

Приложения

После проявления блота с помощью рентгеновского излучения или авторадиографии результаты можно проанализировать и интерпретировать для определения приблизительного размера и концентрации РНК-связывающего белка (белков), представляющего интерес для дальнейшего изучения белка (белков). Расположение и концентрация связывающего РНК белка на блоте могут повлиять на результаты, а полосы иногда могут появляться после проявления. Эти полосы могут помочь исследователям определить размер и концентрацию интересующего РНК-связывающего белка.[12] Когда приблизительный размер белка известен, исходный образец можно запустить на хроматография машину разделить по размеру.[13] Кроме того, как только белок выделен, он может быть переварен трипсином, и масс-спектрометрия может быть использована для секвенирования пептидов с целью определения идентичности конкретного белка.[14]

Преимущества и недостатки

Преимущества северо-западного блоттинга включают ускоренное обнаружение специфических белков, которые связывают РНК, а также оценку приблизительного молекулярного веса этих белков.[15] Северо-западный блот позволяет обнаруживать идентифицированные белки недорогим способом. Блоттинг, как правило, является первым шагом в исследовании, поскольку он позволяет идентифицировать приблизительный молекулярный вес, а после того, как молекулярный вес известен, он позволяет проводить дальнейшие исследования или очистку с помощью других методов, таких как хроматография. Еще одно преимущество северо-западного блоттинга состоит в том, что он помогает создавать библиотеки экспрессии родственных лигандов.[16]

Отмеченный недостаток заключается в том, что некоторые взаимодействия РНК-белок с плохими свойствами связывания РНК могут быть не столь детектируемыми с помощью этого метода.[15] Также процедура блоттинга может занять от 3 до 5 часов. Если процедура не выполнена правильно, это может привести к значительному фону, который может привести к нечеткому блоттингу идентифицированных белков. Кроме того, белки должны ренатурировать после разделения и переноса на нитроцеллюлозную мембрану. Последний недостаток состоит в том, что белки должны состоять из одного полипептида или двух субъединиц, которые объединяются в гелевой матрице.[17]

Смотрите также

Протоколы

Северо-западный блот взаимодействия белок-РНК из молодых метелок риса

Выделение РНК и Нозерн-блоттинг

Протеиновый блоттинг

использованная литература

  1. ^ а б Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Выявление специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии. 98 (3): 503–517. Дои:10.1016 / S0022-2836 (75) 80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  2. ^ а б Нельсон, Кокс (2013). Принципы биохимии Ленингера. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: W.H. Фримен и компания. п. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1.
  3. ^ Альбертс, Б., Джонсон, А., Льюис, Дж. Рафф, М., Робертс, К., Уолтер, П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, стр. 538-539.
  4. ^ Кевил, К. Г., Уолш, Л., Лару, Ф. С., Калогерис, Т., Гришем, М. Б., Александер, Дж. С. (1997) Улучшенный быстрый северный протокол. Biochem. и Biophys. Research Comm. 238: 277-279.
  5. ^ а б Рэпли, Р. (2000). Справочник по протоколам нуклеиновых кислот. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press Inc., стр. 783. ISBN 978-0-89603-459-4.
  6. ^ Николай; Нельсон (2013). «Север, Юг или Восток? Методы промокания». Журнал следственной дерматологии. 133 (e10): e10. Дои:10.1038 / jid.2013.216. PMID 23760052.
  7. ^ Верена, Биксель; Альфред Вальц; Матиас Бикель (1997). «Идентификация белков, специфически связывающихся с 3'-нетранслируемой областью гранулоцитов / макрофагов, стимулирующих мРНК факто-колонии» (PDF). Исследования нуклеиновых кислот. 25 (12): 2417–2423. Дои:10.1093 / nar / 25.12.2417. ЧВК 146745. PMID 9171094. Получено 7 мая 2014.
  8. ^ Ляо, Хьюи-Джейн; Рюдзи Кобяши и Майкл Б. Мэтьюз; Мэтьюз, М. Б. (21 июля 1998 г.). «Активность РНК, ассоциированных с аденовирусом: очистка и характеристика РНК-связывающих белков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 95 (15): 8514–9. Bibcode:1998PNAS ... 95.8514L. Дои:10.1073 / пнас.95.15.8514. ЧВК 21107. PMID 9671709.
  9. ^ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Бахманн М (2009). Использование нерадиоактивного метода обнаружения для северо- и юго-западного блоттинга.. Методы молекулярной биологии. 536. С. 441–9. Дои:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081.
  10. ^ Шумахер, Джилл; Кисук Ли; Сюзанна Эдельхофф; Роберт Браун (май 1995 г.). «Spnr, мышиный РНК-связывающий белок, локализованный в цитоплазматических микротрубочках». Журнал клеточной биологии. 129 (4): 1023–1032. Дои:10.1083 / jcb.129.4.1023. ЧВК 2120489. PMID 7744952.
  11. ^ Stohlman, S.A.; R S Baric; Г. Н. Нельсон; L H Soe; L M Welter; Р. Дж. Динс (1988). «Специфическое взаимодействие между лидерной РНК коронавируса и белком нуклеокапсида». Журнал вирусологии. 11. 62 (11): 4288–95. Дои:10.1128 / JVI.62.11.4288-4295.1988. ЧВК 253863. PMID 2845141. Получено 25 марта 2014.
  12. ^ Тангасами, Саминатан. "Северо-западный блот взаимодействия белок-РНК из молодых метелок риса". Получено 26 марта 2014.
  13. ^ Пердью, Гэри (17 августа 2008 г.). Регуляция экспрессии генов: молекулярные механизмы. Springer. п. 129. ISBN 9781597452281.
  14. ^ Гэри Х. Пердью; Джек П. Ванден Хеувел; Джеффри М. Питерс (2008). Регуляция экспрессии генов: молекулярные механизмы. Springer. п. 129. ISBN 9781597452281.
  15. ^ а б Смит, Кристофер У.Дж. (1998). РНК-белковые взаимодействия: практический подход: практический подход. Издательство Оксфордского университета. п. 187. ISBN 9780191591624.
  16. ^ Уолдо, Коэн (16 августа 1991 г.). Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии. Академическая пресса. п. 186. ISBN 9780080863290.
  17. ^ Николсон, Аллен В. (2001). Рибонуклеазы, Часть A: Функциональные роли и механизмы действия: Функциональные роли и механизмы действия. Академическая пресса. п. 409. ISBN 9780080496917.