WikiDer > Кленовский фрагмент

Klenow fragment
Функциональные домены во фрагменте Кленова (слева) и ДНК-полимеразе I (PDB).

В Кленовский фрагмент большой белок фрагмент произведен, когда ДНК-полимераза I из Кишечная палочка является ферментативно расколотый протеаза субтилизин. Впервые сообщалось в 1970 г.[1] он сохраняет 5 '→ 3' полимераза активность и 3 ’→ 5’ экзонуклеаза активность по удалению прекодирующих нуклеотидов и проверке, но теряет свою 5 '→ 3' экзонуклеазную активность.

Другой меньший фрагмент образовался, когда ДНК-полимераза I из Кишечная палочка расщепляется субтилизином, сохраняет 5 '→ 3' экзонуклеазную активность, но не имеет двух других активностей, проявляемых фрагментом Кленова (т.е. 5 '→ 3' полимеразная активность и 3 '→ 5' экзонуклеазная активность).

Исследование

Поскольку 5 '→ 3' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из Кишечная палочка делает его непригодным для многих приложений, фрагмент Кленова, в котором отсутствует эта активность, может быть очень полезен в исследованиях. Фрагмент Кленова чрезвычайно полезен для исследовательских задач, таких как:

  • Синтез двухцепочечной ДНК из одноцепочечных матриц
  • Заполнение отступивших 3-дюймовых концов фрагментов ДНК, чтобы сделать 5-футовый выступ тупым
  • Переваривание выступающих 3-футовых выступов
  • Подготовка радиоактивный ДНК-зонды

Фрагмент Кленова также был исходным ферментом, который использовался для значительного усиления сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) процесс,[2] перед заменой термостабильными ферментами, такими как Полимераза Taq.[3]

Фрагмент экзо-Кленова

Так же, как 5 '→ 3' экзонуклеаза деятельность ДНК-полимераза I из Кишечная палочка может быть нежелательным, 3 '→ 5' экзонуклеаза активность фрагмента Кленова также может быть нежелательной для определенных приложений. Эту проблему можно решить, введя мутации в гене, кодирующем Кленова. Это приводит к экспрессии форм фермента, которые сохраняют 5 '→ 3' полимеразную активность, но не имеют экзонуклеаза активность (5 '→ 3' или 3 '→ 5'). Эта форма фермента называется экзо- фрагмент Кленова.

Фрагмент экзо-Кленова используется в некоторых реакциях флуоресцентного мечения для микрочипов, а также в хвостах dA и dT, важном этапе процесса лигирования адаптеров ДНК к фрагментам ДНК, часто используемых при подготовке библиотек ДНК для секвенирования Next-Gen. (например см. [1])

Рекомендации

  1. ^ Klenow H и Henningsen I. (1970). «Селективное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B путем ограниченного протеолиза». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 65 (1): 168–175. Дои:10.1073 / pnas.65.1.168. ЧВК 286206. PMID 4905667.
  2. ^ Сайки Р.К. и др. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука. 230: 1350–54. Дои:10.1126 / science.2999980. PMID 2999980.
  3. ^ Сайки; и другие. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Наука. 239: 487–91. Дои:10.1126 / science.239.4839.487. PMID 2448875.

внешняя ссылка