WikiDer > Нативное химическое лигирование

Native chemical ligation

Нативное химическое лигирование или же NCL является важным продолжением химическая перевязка поле, концепция построения большого полипептид образуется сборкой двух или более незащищенных сегментов пептида.[1] В частности, NCL является наиболее мощным методом лигирования для синтеза нативных белков основной цепи или модифицированных белков умеренного размера (т.е., маленький белки<200 AA).

Реакция

При нативной химической перевязке тиол группа N-терминала цистеин остаток незащищенного пептида 2 атакует C-терминал тиоэфир второго незащищенного пептида 1 в водном буфере при pH 7,0, 20 ° C 3. Этот промежуточный продукт перестраивается внутримолекулярным S, N-ацильный сдвиг что приводит к образованию нативного амида ('пептид') связь 4 в месте лигирования (схема 1).

Схема 1. Двухступенчатый механизм нативного химического лигирования.

Примечания:

  • Тиоловые добавки:

Реакция NCL катализируется транстиоэтерификацией in situ с добавками тиолов. На сегодняшний день наиболее распространенными тиоловыми катализаторами являются смеси тиофенила, 4-меркаптофенилуксусная кислота (MPAA) или 2-меркаптоэтансульфонат (МЕСНа). (ссылка)

В Основное свойство метода NCL - обратимость первого шагареакция тиол (ат) -тиоэфирного обмена. Нативное химическое лигирование является исключительно региоселективным, потому что эта стадия обмена тиол (ат) -тиоэфир свободно обратима в присутствии экзогенного тиола, добавленного в качестве катализатора. Высокий выход полученного конечного продукта лигирования, даже в присутствии внутренних остатков Cys в одном / обоих сегментах, является результатом необратимости в используемых условиях реакции второго (сдвиг ацильной группы S в N) амида- этап формирования.

Побочные продукты не образуются в результате реакции с другими функциональными группами, присутствующими в любом из пептидных сегментов (кислоты или основные аминогруппы, фенольные гидроксилы и т. Д.).

Исторический контекст

В 1953 году Теодор Виланд и его сотрудники открыли химическую основу этой реакции, когда реакция валин-тиоэфир и цистеин аминокислота в водном буфере дает дипептид валин-цистеин.[2] Реакция протекает через промежуточный тиоэфир, содержащий серу остатка цистеина. Работа Виланда привела к методу «активного сложного эфира» для создания защищенных пептидных сегментов при обычном синтезе в растворах в органических растворителях.

В 1990-е годы Стивен Кент и коллеги в Научно-исследовательский институт Скриппса независимо разработал "Native Chemical Ligation", первый практический метод лигирования больших незащищенных пептидных фрагментов.

Характеристики

Нативное химическое лигирование проводится в водном растворе и часто дает почти количественные выходы желаемого продукта лигирования. Задача состоит в получении необходимого незащищенного строительного блока пептид-тиоэфир. Пептидтиоэфиры обычно получают Boc Chemistry SPPS; пептид, содержащий тиоэфир, не может быть синтезирован с использованием нуклеофильного основания, что отрицательно сказывается на химии Fmoc. Известны методы твердофазного пептидного синтеза Fmoc Chemistry для получения пептид-тиоэфиров; они используют модификации линкера «предохранителя» Кеннера. При создании пептидных сегментов для использования в нативном химическом лигировании защитные группы, которые высвобождают альдегиды или же кетоны следует избегать, поскольку они могут блокировать N-концевой цистеин. По той же причине использование ацетон следует избегать, особенно до лиофилизация и при мытье посуды.

Особенностью метода нативного химического лигирования является то, что полипептидная цепь продукта содержит цистеин в месте лигирования. Для некоторых белков гомоцистеин могут быть использованы и метилированы после лигирования с образованием метионин, хотя на этой стадии алкилирования могут происходить побочные реакции. Цистеин на сайте лигирования также может быть десульфуризован до аланин; совсем недавно другие бета-тиолсодержащие аминокислоты были использованы для нативного химического лигирования с последующим обессериванием. В качестве альтернативы можно использовать тиолсодержащие вспомогательные вещества для лигирования, которые имитируют N-концевой цистеин для реакции лигирования, но которые можно удалить после синтеза. Использование тиолсодержащих вспомогательных веществ не так эффективно, как лигирование по остатку Cys. Нативное химическое лигирование также может быть выполнено с N-концевым остатком селеноцистеина.[3]

Преимущество нативного метода химического лигирования заключается в том, что связывание длинных пептидов с помощью этого метода во многих случаях является почти количественным и обеспечивает синтетический доступ к большим пептидам и белкам, которые иначе невозможно сделать из-за длины или декорирования посттрансляционной модификацией. Нативное химическое лигирование составляет основу современного химического синтеза белков и используется для получения множества белков и ферментов путем полного химического синтеза.

С-концевые тиоэфиры полипептида, полученные методами рекомбинантной ДНК, могут реагировать с N-концевым Cys-содержащим полипептидом с помощью той же самой нативной химии лигирования с получением очень больших полусинтетических белков. Нативное химическое лигирование такого типа с использованием сегмента рекомбинантного полипептида известно как лигирование экспрессированного белка. Точно так же рекомбинантный белок, содержащий N-концевой Cys, может реагировать с синтетическим полипептидным тиоэфиром. Таким образом, естественное химическое лигирование можно использовать для введения химически синтезированных сегментов в рекомбинантные белки независимо от размера.

Полипептидные С-концевые тиоэфиры также могут быть получены на месте, используя так называемые N, S-системы ацильного сдвига. Бис(2-сульфанилэтил) амидогруппа, также называемая группой SEA, принадлежит к этому семейству. С-концевой полипептид бис(2-сульфанилэтил) амиды (сегменты пептида SEA) реагируют с пептидом Cys с образованием нативной пептидной связи, как в NCL. Эта реакция, которая называется Лигирование природных пептидов SEA, является полезным расширением Native Chemical Ligation.[4][5]

Ограничение размера

Было доказано, что NCL является удобным методом химического синтеза белков длиной более 100 аминокислот, что продемонстрировано на полипептидной цепи из 166 аминокислот синтетического варианта эритропоэтин и протеаза ВИЧ-1 из 203 аминокислот.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Dawson, P.E .; Muir, T. W .; Кларк-Льюис, I .; Кент, С. Б. (1994). «Синтез белков нативным химическим лигированием». Наука. 266 (5186): 776–778. Bibcode:1994Наука ... 266..776D. Дои:10.1126 / science.7973629. PMID 7973629.
  2. ^ Виланд, Т .; Bokelmann, E .; Bauer, L .; Lang, H.U .; Лау, H (1953). "Über Peptidsynthesen. 8. Mitteilung Bildung von S-haltigen Peptiden durch intramolekulare Wanderung von Aminoacylresten". Liebigs Ann. Chem. 583: 129–149. Дои:10.1002 / jlac.19535830110.
  3. ^ McGrath, N.A .; Рейнс, Р. Т. (2011). «Хемоселективность в химической биологии: реакции переноса ацила с серой и селеном». Соотв. Chem. Res. 44 (9): 752–761. Дои:10.1021 / ar200081s. ЧВК 3242736. PMID 21639109.
  4. ^ Оливье, Н. Деур, Дж. Мхидиа, Р. Бланпейн, А. Мельник, О. (2010). «Лигирование нативного пептида бис (2-сульфанилэтил) амино». Органические буквы. 12 (22): 5238–41. Дои:10.1021 / ol102273u. PMID 20964289.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  5. ^ Мельник, О .; и другие. "(WO2011051906) СПОСОБ НАТУРАЛЬНОГО ЛИГАЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ". Заявка на патент WO.

дальнейшее чтение